小檗堿與芒果苷及其配伍對L6成纖維細胞葡萄糖攝取的影響及機制

吳 巍，滕厚雷

(海南德澤藥物研究有限公司，海南海口 570105)

小檗堿與芒果苷皆為來源于植物的天然產物，具有抗糖尿病等多種藥理活性。李學堅等［1－3］曾報道小檗堿與芒果苷配伍具有抗炎、抑菌、鎮痛、降糖的藥理活性，但二者配伍后在細胞水平的研究尚未見報道。該文以葡萄糖攝取為切入點，觀察二者配伍對葡萄糖攝取的影響，并進而研究二者配伍對葡萄糖攝取信號通路的影響。以期為進一步評價二者配伍在治療糖尿病方面的意義提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 芒果苷、鹽酸小檗堿，經HPLC鑒定二者純度＞98%;小檗堿配伍芒果苷(將鹽酸小檗堿與芒果苷以摩爾比1∶1配伍，簡稱BM):海南德澤藥物研究有限公司自制。

大鼠 L6成纖維細胞(簡稱 L6細胞，ATCC)、HGDMEM培養基(Gibco公司)、胎牛血清(Hyclone公司)、2-脫氧葡萄糖(Sigma)、［3H］-2-脫氧葡萄糖(Amersham Pharmacia);AMPK磷酸化抗體(Thr172)、AMPK本底抗體、ACC磷酸化抗體(Ser79)均購自Cell Signaling公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 L6細胞培養及分化 置于37℃、5%CO2的培養箱中，用HG-DMEM培養基培養。

1.2.2 2-脫氧葡萄糖攝取 L6細胞在無血清的HG-DMEM培養基中饑餓2 h?；衔镆圆煌臐舛忍荻燃拥脚囵B基中孵育2.5 h，然后更換含有化合物的 HBS溶液，以1 μmol·L－1的胰島素作為陽性對照，再孵育0.5 h。加入終濃度為0.1 mmol·L－1的二位脫氧葡萄糖和 1.85 ×107Bq·L－1的二位3H同位素標記的二位脫氧葡萄糖，用Microbeta儀器閃爍計數。測細胞裂解液的總蛋白濃度來定細胞數量。以空白對照孔的葡萄糖吸收數值為100%，計算化合物孔及陽性對照孔的葡萄糖吸收百分比。

將芒果苷、小檗堿及BM與陽性對照胰島素的數據相比所得的各受試物與胰島素的相對效力比作為評價指標，以平行對比芒果苷、小檗堿及BM對糖攝取的影響。

1.2.3 免疫印跡檢測AMPK磷酸化水平 L6細胞在無血清的HG-DMEM培養基中饑餓3 h。化合物以不同的濃度梯度加到培養基中孵育2～3 h，收樣。SDS-PAGE轉膜，再分別與抗 AMPK-p、AMPK、ACC-p、β-actin的一抗 4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，分別加二抗，室溫孵育1 h，洗膜3次，最后用ECL底物顯影曝光。

1.3 統計學處理 組間比較采用SPSS 13.0軟件進行方差分析或t檢驗。

2 結果

2.1 小檗堿與芒果苷配伍對L6細胞糖攝取的影響 0.625 μmol·L－1濃度下，BM、小檗堿、芒果苷與胰島素的相對效力比分別為(91.26±13.28)%、(61.34±6.08)%、(51.45±7.94)%;BM與小檗堿比差異有顯著性(P＜0.05)，與芒果苷比差異有顯著性(P＜0.01)。

1.25 μmol·L－1濃度下，BM、小檗堿、芒果苷與胰島素的相對效力比分別為(101.06±4.57)%、(70.77±6.43)%、(52.85±8.09)%;BM與小檗堿比差異有顯著性(P＜0.01)，與芒果苷比差異有顯著性(P＜0.01)。

2.5 μmol·L－1濃度下，BM、小檗堿、芒果苷與胰島素的相對效力比分別為(102.13±4.77)%、(91.04±9.58)%、(49.30±5.47)%;BM與小檗堿比差異無顯著性(P＞0.05)，與芒果苷比差異有顯著性(P＜0.01)。

5 μmol·L－1濃度下，BM、小檗堿、芒果苷與胰島素的相對效力比分別為(120.47±12.48)%、(98.66±4.19)%、(49.32±2.20)%;BM與小檗堿比差異有顯著性(P＜0.05)，與芒果苷比差異有顯著性(P＜0.01)。

試驗結果表明:BM與小檗堿均能促進L6細胞的葡萄糖攝取，但芒果苷未表現出促葡萄糖攝取作用。BM與芒果苷、小檗堿比較，活性增強，表明芒果苷與小檗堿配伍具有協同作用。

2.2 小檗堿與芒果苷配伍對L6細胞AMPK與ACC磷酸化水平的影響 1.25、2.5、5.0 μmol·L－1BM 能提高 L6 細胞AMPK及其下游底物ACC的磷酸化水平，呈濃度依賴性。2.5、5.0、10 μmol·L－1小檗堿能提高 L6 細胞 AMPK 及 ACC的磷酸化水平，呈濃度依賴性。1.0、2.0 μmol·L－1芒果苷未能提高L6細胞AMPK及ACC的磷酸化水平，4.0 μmol·L－1芒果苷能提高L6細胞AMPK的磷酸化水平，但未能明顯提高ACC的磷酸化水平。

3 討論

文獻報道小檗堿、芒果苷可以促進L6成纖維細胞的葡萄糖攝取，機制是通過激活AMPK信號通路，增加GLUT的表達與轉位，從而促進細胞對葡萄糖的攝?。?～7］。

我們的研究結果亦表明小檗堿、芒果苷可以促進AMPK磷酸化，小檗堿可以促L6細胞葡萄糖攝取，但芒果苷卻未表現出促葡萄糖攝取作用。此項研究結果的不同，是否與實驗方法不同有關，尚有待進一步研究。

在葡萄糖攝取試驗中，小檗堿與芒果苷配伍后表現出優于各單體的活性作用，表明二者配伍具有協同作用。為揭示小檗堿與芒果苷的配伍意義，以進一步將小檗堿與芒果苷配伍開發為新藥提供實驗依據。

AMPK是一種異源三聚體蛋白，被稱為細胞的“代謝感受器”。AMPK的活化能夠調節葡萄糖和脂類代謝，抑制胰島素抵抗，對2型糖尿病患者骨骼肌和肝臟具有明顯的保護作用。因此，AMPK及其信號通路極有可能作為研發新型抗2型糖尿病藥物有效的藥理學靶點［8］。因此，尋找激活AMPK的小分子藥物，將是未來治療2型糖尿病可能的途徑。

小檗堿與芒果苷配伍，可明顯促進L6細胞的葡萄糖攝取與AMPK磷酸化。說明小檗堿與芒果苷配伍是通過激活AMPK信號通路發揮促葡萄糖攝取作用的。此研究結果為將小檗堿與芒果苷配伍的新藥開發為AMPK激動劑提供實驗依據。

(致謝:感謝中科院上海藥物研究所國家新藥篩選中心李靜雅博士、李佳博士、張薇博士給予的技術支持。)

［1］李學堅，鄧家剛，覃振林，等.芒果苷小檗堿組合物降血糖作用的試驗研究［J］.中國現代中藥，2008，10(12):26 －8.

［1］Li X J，Deng J G，Qin Z L，et al.Experimental study on hypoglycemic effect of the mixture of mangiferin and berberine［J］.Mod Chin Med，2008，10(12):26 －8.

［2］李學堅，鄧家剛，覃振林，等.芒果苷小檗堿組合物對大鼠實驗性子宮炎癥的影響［J］.時珍國醫國藥，2008，19(12):3008－9.

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［3］李學堅，鄧家剛，覃振林，等.芒果苷、小檗堿組合物抑菌、抗炎、鎮痛作用的研究［J］.中國中醫藥科技，2010，17(1):36－7.

［3］Li X J，Deng J G，Qin Z L，et al.Study on Bacteriostasis and antiinflammatory and analgesic effect of the mixture of mangiferin and berberine［J］.Chin J Tradit Med Sci Technol，2010，17(1):36 －7.

［4］Cheng Z，Pang T，Gu M，et al.Berberine-stimulated glucose uptake in L6 myotubes involves both AMPK and p38 MAPK［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1760(11):1682 －9.

［5］Yin J，Gao Z，Liu D，et al.Berberine improves glucose metabolism through induction of glycolysis［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2008，294(1):E148 －56.

［6］Zhou L，Yang Y，Wang X，et al.Berberine stimulates glucose transport through a mechanism distinct from insulin［J］.Metabolism，2007，56(3):405 －12.

［7］Girón M D，Sevillano N，Salto R，et al.Salacia oblonga extract increases glucose transporter 4-mediated glucose uptake in L6 rat myotubes:Role of mangiferin［J］.Clin Nutr，2009，28(5):565 －74.

［8］葛 斌，謝梅林，顧振綸，等.AMPK作為治療2型糖尿病新靶點的研究進展［J］.中國藥理學通報，2008，24(5):580 －3.

［8］Ge B，Xie M L，Gu Z L，et al.AMPK acts as a new target for the treatment of type 2 diabetes［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(5):580－3.