中醫證候與基因、蛋白質、代謝組學研究思路探討

朱明丹,杜武勛,姜 民,劉長玉,宋啟剛,魏 營

(1.天津中醫藥大學第二附屬醫院,天津 300193;2.天津南開大學藥學院,天津 300071)

證候實質的研究一直是中醫學術界研究的熱點。幾十年來國家投入大量的人力和財力,但其研究并未取得突破性的成果,甚至陷入了矛盾和困惑的境地。近幾年來,基因組學、蛋白質組學、代謝組學等現代科技的誕生似乎又給中醫證候學的研究帶來了新的曙光和前途。

1 中醫證候實質研究的目的與思路的歷史回顧

中醫的 “證”是辨證論治的起點和核心。“證”是指在疾病的發生、發展過程中,一組具有內在聯系的、能夠反映疾病過程在某一階段的病機,是機體對體內外各種環境變化和致病因素作出反映的一種功能狀態。由于中醫的證候是通過望、聞、問、切四診所獲得的一組有相互關聯的癥狀和體征群的信息整理而得,缺乏客觀指征,臨床的把握上很大程度上依賴于醫生的診療水平。

為此,許多學者期望依賴現代科學技術手段進一步闡明證候實質。在現代醫學的“實證主義”和“還原論”思想指導下,人們希望通過證候物質基礎的尋找,找到證候的特異性指標,探索證候的高特異性和高靈敏性指標,試圖建立證候實驗診斷單個金指標,從而實現證候的微觀辨證依據。研究者不斷從不同角度及層次研究與“證”相關的實驗室指標。隨著“證”本質研究的廣泛深入開展,某些指標的特異性逐漸被否定,甚至許多觀察指標出現了相矛盾的結果[1]。因此,人們看到現有的實驗指標及單系統、單層次的研究已經難以全面揭示證候的科學內涵。

20世紀中葉以來,人類基因組學研究的方法和內容與中醫學整體觀、辨證觀有許多相似之處。國家中醫藥管理局在中醫現代化科技發展戰略研究中,制訂了證候研究的科研思路,其中提出了證候與蛋白質組學的研究。其理論依據是,“真核細胞生物基因功能復雜,但基因總要表達為相應的蛋白質才能產生生物功能,而且一般情況下,基因組只表達一部分基因,其表達類型均受到生存環境及內在狀態變化的影響而有較大差異。因此采用對一個基因組的全套蛋白質,一個細胞乃至一個組織的全套蛋白質的蛋白組學研究方法進行證候研究具有更重要的意義”。國家自然科學基金 2006年中醫藥重大研究計劃招標指南指出:“證候與疾病和方劑的相關性理論是中醫基礎理論建立的最根本問題”,圍繞疾病證候病機和方劑的相關性這一中醫證候研究的重要科學問題,突出中醫學思維特征與現代科學設計融合的研究思路,以方劑干預的治療效果作為參照標準,用蛋白質組學技術為研究手段,基于中醫以方測證的逆向思維的認“證”方法,不斷積累、完善,應能從蛋白水平上找到方證相應理論的物質基礎以及解決“證”本質問題,構建出具有堅實臨床科學基礎的證候標準。

因此,近年來有學者提出利用基因組學、蛋白質組學研究中醫證候的設想,并提出“證候基因組學”、“證候蛋白質組學”等概念,試圖在分子水平描繪中醫證候本質的全貌。就分子水平而言,證候不一,基因表達譜也不一樣,“證”的本質是基因型及其表達,體外能用肉眼觀察到的癥狀和體征變化具有其分子基礎,是基因及其在 mRNA、蛋白質水平差異的外在表現,結合臨床辨證分型,提出證候基因組學、證候蛋白質組學理論,提倡通過分子流行病學調查,綜合 mRNA、蛋白質等多種分子生物學標志物,引入分子生物學方法、蛋白質組學方法。如 mRNA差異顯示法、差異二維蛋白質電泳方法,從 mRNA、蛋白質水平探討中醫“證”的實質、證的分類、證的辨治、證的演變規律,闡明證的基因表型、蛋白質表形及其轉化[2]。通過對正常及病變樣本蛋白質組分差異的比較和相同疾病不同證型之間的比較,就有可能從整體上發現某些疾病或同病異證的特有蛋白質的表達,建立蛋白質多態性與疾病中醫分型、辨證用藥之間的系統的有規律的聯系,在復雜的多種致病因素作用下找到證候的共同本質[3]。

中醫證候實質的研究,其目的就是要用現代醫學理論揭示中醫證理論中蘊藏的科學內涵,闡明中醫診斷和治療各種證及其相關疾病的微觀機制,學者們希望用現代科學技術的手段,找到中醫證候的物質基礎,以期闡明證候的科學內涵,期望如現代醫學對某病的診斷一樣,找到客觀的指標。

2 冠心病中醫證候與基因、蛋白質、代謝組學研究的現狀

基因、蛋白質、代謝組學研究,給證候的進一步研究帶來更多機遇與啟示,但能否全面詮釋證候的本質,沿著這一研究的目的和研究思路,我們最終能走到何處。為了達到科學研究的目的,必須有達到目的的正確的方法和手段,在這一研究過程中我們必須審視我們的研究思路。以冠心病為例,綜合目前的研究需要我們冷靜思考。

綜觀目前在冠心病證候學研究方面,許多學者進行了有益的探索。朱萱萱[4]等研究冠心病患者與健康人以及冠心病患者之間在代謝組學方面存在的差異。男性的 score plot圖中,健康對照組、氣虛血瘀證和痰阻心脈證相應集中在 3個不同區域,完全沒有重疊,區分度很高。女性的 score plot圖中,健康對照組、氣虛血瘀證、痰阻心脈證和氣陰兩虛證相應集中在 4個不同區域,基本沒有重疊,區分度也很高,提示代謝組學方法可能成為冠心病的病因病機以及中醫辨證分型新的研究手段。劉衛紅[5]等運用代謝組學技術,動態觀察高脂血癥向動脈粥樣硬化發展過程中“由痰致瘀”的生化物質基礎。高脂血癥前期以脂質代謝紊亂為特點,即高脂血癥痰濁的生化物質基礎,隨著病程進展,乙酰糖蛋白尤其是 O-乙酰糖蛋白的出現,說明凝血機制出現異常。由于參與血液凝固過程的纖維蛋白原、凝血酶原和幾種凝血因子都是糖蛋白,因此乙酰糖蛋白譜峰的改變可能是高脂血癥大鼠模型血瘀的早期生物標記物。同時脂肪產生熱量供機體活動的需要時,脂肪分解產生酮體及能量代謝產生大量乳酸,使脂質代謝紊亂進一步加重,這與同時檢測的血脂、血流變結果相一致。分析這些內源性代謝產物的形成、轉移機制和過程,可提示痰瘀證候的動態演變、時相特點和由痰致瘀的條件,從而揭示其生物學本質。吳紅金[6]等采集正常健康者、冠心病心血瘀阻證病人的血漿,用雙向電泳、圖像分析技術發現,冠心病血瘀證病人血漿與正常相比有 3個蛋白質下調和 6個蛋白質上調,用膠內酶切提取蛋白進行質譜鑒定,其中冠心病血瘀證病人血漿與正常相比升高的蛋白質有免疫球蛋白、纖維蛋白原、粒酶,與正常相比降低的蛋白有 CD44SP,而這些蛋白有望發展成為冠心病血瘀證病人血漿中的診斷標志物。趙慧輝[7]等采用 DIGE差異凝膠電泳和串聯質譜對 8例冠心病不穩定性心絞痛血瘀證患者血瘀證程度變化前后及健康人的血漿進行蛋白質組學的比較研究。初步發現,Clusterin、ApoA-I在冠心病不穩定性心絞痛血瘀證患者的血漿中,表達低于健康人,血瘀證程度變輕后表達增加。而 Fibrinogenβchain、VitaminD-Binding Protein、Haptoglobinβchain、Haptoglobinα2 chain在冠心病不穩定性心絞痛血瘀證患者的血漿中,表達高于健康人,血瘀證程度變輕后表達降低。認為Clusterin、ApoA-I、Fibrinogenβchain、Vitamin DBinding Protein、Haptoglobinβchain、Haptoglobinα2 chain可能與冠心病不穩定性心絞痛血瘀證相關。

另一方面,冠心病辨證分型目前沒有統一標準,更何況王曉才等研究冠心病證候組合以三證組合最為多見,兩證組合多為氣虛血瘀證,三證組合多為氣虛血瘀證合并陰虛證或痰濁證或陽虛證,四證組合多氣虛血瘀陽虛證合并陰虛證或痰濁證或寒凝證,五證組合為氣虛血瘀陽虛寒凝證合并陰虛證或痰濁證[8]。如此復雜的證候組合,并且許多中醫的證候是根據中醫理論,從理論推演而來,如氣虛,有氣虛下陷,宗氣下陷,大氣下陷等;又有腎不納氣等不同概念,又可分為肝氣、脾氣、心氣、肺氣,腎氣等。并且血瘀證又結合臟腑有心血瘀,肝血瘀證等。

3 中醫證候與基因、蛋白質、代謝組學研究的審視和思考

通過以上有關證候與基因、蛋白質、代謝組學研究情況的分析不難看出,雖然基因、蛋白質、代謝組學是從整體上研究疾病發生的機制,解決了以往研究的單一組織、單一器官、單一系統的研究方法,但是所采取的研究思路仍是還原分析方法研究證候概念,以尋找證候特異物質為目標,甚至是基因和蛋白質為指標。但據此法研究中醫證候,可能又回到以往的老路,陷入以往還原分析方法的泥潭,以至于可能毫無功效。

中醫的證候是根據中醫理論推演而來,而在目前所進行的的研究中中醫分型的標準不一,又加之證候組合復雜,無法就研究結果進行統一分析。

情志致病和心理因素在中醫的證候學形成中占有重要位置。目前基因的結構和功能還難以闡明,諸如感覺、思維、意識等高級神經活動的機制。因此,單純的基因、蛋白質、代謝組學對人的本質、證候本質的闡述都是不全面的[9]。

許多學者提出了證候研究應注意到病證結合研究。在證候本質研究中,證候受病的制約,證候與病之間呈交織網絡的關系,即一證可見于多種疾病之中,一種疾病又可見若干證型。由于現代科學的發展,對疾病的認識也越來越深入,中醫研究者也趨向于采用病證結合的模式進行研究,這樣更容易使中醫與現代科學找到契合點。所以我們應嚴格確立疾病的納入、排除標準,使疾病單純化[10];嚴格確立方劑的適應證,即證候納入的辨證標準,嚴格篩選病例,為此證候規范化是實現中醫學標準化和現代化的重要步驟,建立規范化的證候診斷標準是證候深入研究和多中心協作研究的前提和基礎。

采用方證相關的研究方法,認為方證相關強調了方劑與其作用對象之間的相互作用,即方劑的功用是特定方藥與其作用對象特定證之間相互作用的結果。方證相關也提示從單一角度對方或對證的研究,有可能背離中醫學術的內在邏輯,而將方與證結合起來考慮則可大大提高研究效度[11]。并且提出了動態研究等的研究中應該注意的問題。但是中醫證候的復雜性表明,對于證候的研究不能單純使用西醫學的手段和方法,證候與致病因素之間、與理化指標之間、與方劑效應之間都存在著非線性關系,這些非線性關系是導致多年來證候研究出現矛盾和困惑的根源。證候的定位是整體性和亞整體性的,從系統論角度而言,是機體系統質和功能子系統異常的外在表現,證候偏重于功能失調,是對機體整體功能反應狀態的認識和把握[12]。

“證候是人體這個復雜巨系統在病理狀態下的整體反應”,根據復雜系統的認識:復雜系統是由眾多存在復雜相互作用的組分(或子系統)組成的,系統的整體行為(功能或特性)不能由其組分的行為(功能或特征)來獲得。因此在證候與基因、蛋白質、代謝組學研究過程中,應該結合復雜系統的研究方法和思維,更應該認識到證候學研究需要我們正確的研究思路和研究的方法。

當研究的外部干預系統相對簡單時,例如西藥,可以歸納為擾動點,相當于“點”對“系統”的作用。但是當研究的外部干預系統本身是一個復雜系統時,例如中醫方劑,現有的系統生物學尚不能與方證結合的整體化研究相適應。因此我們不僅要在中醫藥研究中應用系統生物學,而且要源于系統生物學和中醫藥學進行創新和提升,發展高于現有系統生物學、適合兩個復雜系統相互作用研究的整體化方案,這也將反過來推動系統生物學和生命科學方法學的發展[13]。

系統生物學的研究思路和方法雖然與中醫學的整體觀和辨證論治有著許多的相似,但是采用拿來主義的方法和手段研究復雜的中醫證候學問題,我們認為是值得我們冷靜思考的,組學在中醫研究中前景看好,但同時也面臨許多問題和挑戰。正是由于證候和中藥的復雜性、整體性、動態性和異病同證、同病異證等特性,再加上由于種族、體質、飲食習慣、氣候、地理環境、年齡、性別乃至患者的心理狀況等諸因素也會影響證候表現的差異。因此,盡管病因、病位、病性基本相同,相同的證候又會表現出不同的亞型,又大大增加了證候組學研究的復雜性。

證候信息多具有模糊性和不確定性,應屬于復雜巨系統范疇。單純用直觀、線性的方法研究證候,已不能適應中醫證候研究的需要。復雜性科學、模糊數學、集對分析和計算機技術的發展給處理以定性描述為主的、動態不確定的信息——證候的內涵及其本質提供了可能。從復雜性科學角度研究中醫藥是近年來在中醫學界興起的新的研究熱點,中醫藥研究中引入復雜性科學研究、非線性科學研究方法,它將對中醫藥的研究提供新的思路和方法,促進中醫藥研究的深入發展[14]。

我們必須對“證候實質”研究、證候物質基礎研究的方向和目的進行深刻的理解和認識,只有吸收與創新,在中醫理論特別是中醫整體觀指導下,運用現代科技思路、方法和手段,創新性地提升我們的研究的方法和思路。

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