植酸酶活性測定方法的研究進展

陜西理工學院 陳 琛

植酸酶廣泛存在于動物、植物和微生物中，能將植酸分解為肌醇和無機磷的一類磷酸單脂水解酶。文章介紹了植酸酶活性的測定方法，除了以前的傳統方法外，近10多年植酸酶活性檢測出現了許多新的方法，如近紅外光譜法、瓊脂平板法、酶聯免疫吸附法、生物傳感器法、高效液相色譜法等，這些新方法為植酸酶活性測定開辟了新的檢測途徑。

1 植酸酶活性測定方法的發展及意義

1.1 植酸酶活性測定方法的發展 植酸酶發現至今已經有100余年，植酸酶的研究已經取得了豐碩的成果?；仡欀菜崦富钚缘臏y定方法：1925年Fiske-SubbaRow法，即鉬黃法，因由Fiske和SubbaRow兩人發現，所以早期鉬黃法也叫Fiske-SubbaRow法；1943年Holman等發現了硫酸亞鐵-鉬藍法，曾在國外許多國家發展為植酸酶測定的標準方法，至今還在許多研究中采用（Fu等，2008；Huang等，2008）；1981 年 Heinonen 和 Lahti建立了丙酮-磷鉬酸銨法。植酸酶活性的測定方法除了這些傳統的方法外，近10多年來隨著科學技術和檢測手段的提高，植酸酶活性分析檢測及標準化方面出現了許多新的方法，并頒布了新的標準，如近紅外光譜法（NIR）、瓊脂平板法、酶聯免疫吸附法（ELISA）、生物傳感器法、反相高效液相色譜法（RP-HPLC）等。

1.2 植酸酶活性測定意義 植酸酶沒有特定光吸收波和鑒定試劑，所以植酸酶的分析和活性測定比較困難（Lasztity等，1990）。動、植物植酸酶的提取、分離純化，微生物植酸酶菌株的篩選，基因工程植酸酶表達產物等研究中都需要測定植酸酶活性。隨著植酸酶在飼料中的廣泛應用，飼料管理部門、飼料質檢機構、科研部門以及生產企業均面臨植酸酶定量測定的工作。目前存在著植酸酶酶活單位混亂、檢測手段落后，測定結果誤差大等一些問題，所以規范植酸酶酶活性定義和檢測方法勢在必行。

植酸酶活性的定義方法主要有以下幾種：（1）酶活定義為每分鐘從一定濃度的植酸鈉溶液中釋放1 μmol的無機磷為一個酶活單位。（2）酶活定義為每分鐘從一定濃度的植酸鈉溶液中釋放1 nmol的無機磷為一個酶活單位。（3）酶活定義為每秒鐘從一定濃度的植酸鈉溶液中釋放1 nmol的無機磷為一個酶活單位。（4）酶活定義為每小時從一定濃度的植酸鈉溶液中釋放1 mg的無機磷為一個酶活單位。這四種定義中第一種的酶活單位最大，國外采用此種單位較多，我們稱之為國際單位；第二種酶活單位是第一種的1000倍；第三種為第一種酶活單位的17倍；第四種與第一種酶活單位大小相近。

目前，植酸酶活性單位大多用FTU（fytase unit）表示。植酸酶樣品在植酸鈉濃度為5.0 mmol/L、溫度37℃、pH值5.50的條件下，每分鐘從植酸鈉中釋放1 μmol無機磷，即為一個植酸酶活性單位，以U表示。1994年該標準被AOAC（美國公定化學分析）在推薦方法中直接引用，作為統一的標準使用。國家標準GB/T18634-2002也采納同樣的定義。

2 植酸酶活性測定方法

2.1 分光光度測定法 分光光度法，也叫吸光光度法，是基于物質對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法，包括可見分光光度法、紫外分光光度法及紅外光譜法等。

植酸酶酶活力測定的基本原理是利用酶水解植酸鈉（肌醇六磷酸十二鈉）形成無機磷，然后測定無機磷的釋放量。常用底物植酸鈉有兩種型號：一種是Sigma p-3168，目前用p-0109替代，相對分子質量為923.8；另一種是Sigma p-8810，相對分子質量為660.03。根據國標要求，植酸鈉應為Sigma p-3168。常用的方法有偏釩酸銨法、硫酸亞鐵-鉬藍法、VC-鉬藍法、丙酮-磷鉬酸銨法，其中前三種是基于可見分光光度法，丙酮-磷鉬酸銨法是基于近紫外法測定。

2.1.1 釩-鉬酸銨法 釩-鉬酸銨法，又稱鉬黃法、偏釩酸銨法。該方法是利用植酸酶可以水解植酸磷釋放出無機磷的原理。在酸性環境下，通過加入鉬-釩試劑與水解釋放出來的無機磷產生顏色反應，形成黃色的釩鉬磷絡合物，在415 nm波長下比色測定磷的含量，以標準植酸酶為參照物，間接計算被測樣品中植酸酶的含量。Kim和Lei（2005）系統研究了該方法的影響因素，并對該方法進行了優化研究，增加了該方法的精確性和重復性。鉬黃法因其標準曲線線性關系好，顏色穩定，干擾物質相對較少而成為測定低含量磷的經典方法。本法于1994年列入AOAC，我國在參考AOAC方法的基礎上制定了 《飼用植酸酶活性的測定—分光光度法》（GB/T18634-2002，修訂GB/T18634-2009）。

2.1.2 硫酸亞鐵-鉬藍法 該方法利用植酸酶可以水解植酸磷釋放無機磷的原理，通過加入三鹽酸使水解反應停止，然后加入鉬酸銨及FeSO4·7H2O的混合液使溶液顯色，在720 nm波長下測定其吸收值，以標準酶為參照物，間接計算被測樣品中植酸酶的含量，稱該方法為FeSO4-鉬藍法。

2.1.3 VC-鉬藍法 該方法的原理是在酸性條件下，定磷試劑中的鉬酸銨以鉬酸形式與樣品中的磷酸反應，當有還原劑存在時，磷鉬酸立即變成藍色的還原物質——鉬藍，形成的藍色物質最大吸收峰在650～660 nm，再以標準磷溶液的吸光度及磷溶液濃度對應的酶活單位建立直線回歸方程，測定無機磷的含量，最后以待測樣品吸光度代入方程，計算出酶活性。

2.1.4 丙酮-磷鉬酸銨法 丙酮-磷鉬酸銨法，依據的原理是磷酸鹽與過量的鉬酸銨在酸性條件下混合后，可緩慢生成黃色磷鉬酸銨，加入丙酮后將黃色物質抽提出來，在355 nm波長處測吸光度，靈敏度增加10倍。

評價一種測定方法重要的標準是精確度、靈敏度、穩定性、抗干擾能力、便宜和方便。不同的測定方法，各有優缺點。釩-鉬酸銨法靈敏度最高，丙酮法穩定性最好，抗干擾能力較強，在測定飼料、發酵產物中植酸酶活性，采用丙酮-磷鉬酸銨方法較好。黃遵錫（1999）研究結果也表明：從靈敏度來說，釩-鉬酸銨法最高，VC-鉬藍法和FeSO4-鉬藍法次之，丙酮法最低，丙酮法的靈敏度與后兩者相比相差較大，近1倍。但是，丙酮法較其他3種方法穩定性及抗干擾能力都較另外3種方法好。

2.1.5 近紅外光譜法 近紅外光譜是可見光與中紅外光譜之間的一段譜區，其波長范圍為750～2500 nm，近紅外光譜分析是指利用近紅外光譜區包含的物質信息，主要用于有機物質定性和定量分析的一種分析技術，具有對樣品無破壞性、操作簡便、分析迅速、測量信號可以遠距離傳輸和分析等特點。Smith等（2001）利用近紅外光譜技術，建立了雞糞便中植酸磷的定量分析模型，對其進行了快速定量分析。楊海鋒等（2008）通過廣譜分析建立了校正模型，認為近紅外光譜技術快速檢測植酸酶酶活含量可行。Selle和Ravindran（2008）認為對近紅外光譜在植酸酶活性分析中應用非常有前景。

2.2 瓊脂平板法 Bae等（1999）建立并優化了瓊脂平板法測定了微生物產植酸酶活性的方法，基于該方法，篩選了動物瘤胃內容物中產植酸酶厭氧細菌。具體方法如下：分離細菌，在含有植酸鈉的培養基 （10%瘤胃液，0.25%葡萄糖，0.25%纖維二糖，0.3%淀粉，1.8%瓊脂，1.0%植酸鈉）上厭氧培養5 d后，移出培養皿置于需氧環境下，洗去培養基表面的細菌，培養皿中加入2%的氯化鈷溶液，室溫培養5 min，傾倒出氯化鈷溶液；培養皿中再加入6.25%的鉬酸銨-0.42%釩酸銨溶液，室溫培養5 min，可產植酸酶的微生物在菌落周圍可產生清晰的條帶。

2.3 基于高效液相色譜測定法 Berry等（2009，2007，2005）人工合成了一個新的發色底物植酸的類似物（TInsP5），以TInsP5作為探針，建立一種快速、高效的測定土壤中植酸酶酶活性的反相高效液相色譜（RP-HPLC）-紫外（UV）檢測方法。方法色譜柱為Sigma公司Supelcosil LC-18-T（150 mm×4.6 mm ID，3 μm）；流動相為甲醇-0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 6.0），比例由 19∶1 變化為11.5∶1，流速1.0 mL/min；檢測波長為 226 nm。TInsP5與待測樣品在45℃溫孵80 min，然后煮沸20 min終止反應，離心用0.22 μm濾膜過濾，樣品與甲醇-0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）等體積混合用于HPLC分析。該方法快速、穩定、靈敏度高，適合體外植酸酶活性的評價研究。

2.4 酶聯免疫吸附法 酶聯免疫吸附法是以免疫反應為基礎，將抗原抗體的特異性反應與酶底物的高效催化產物作用相結合的一種敏感性很高的檢測技術。其具有特異性高、敏感性強、結果易于檢測等特點。Zahradnik等（2004）將酶聯免疫吸附法用于檢測了黑曲霉、大豆、小麥、大米、飼料等11種樣品中的植酸酶活性，檢測靈敏度均達到40 pg/mL，批間變異系數＜10%。

2.5 生物傳感器法 生物傳感器是在生命科學和信息科學之間發展起來的一門交叉學科，對生物物質敏感并將其濃度轉換為電信號進行檢測的儀器。最早的生物傳感器發明于1962年，Clark和Lyon利用不同的物質與不同的酶層發生反應的工作原理，在傳統的離子選擇性電極上固定了具有生物功能選擇的酶，從而構成了最早的生物傳感器——酶電極。生物傳感器是由固定化的生物敏感材料作識別元件（包括酶、抗體、抗原、微生物、細胞、組織、核酸等生物活性物質）與適當的理化換能器（如氧電極、光敏管、場效應管、壓電晶體等等）及信號放大裝置構成的分析工具或系統。生物傳感器具有接受器與轉換器的功能。Mak等（2004）把植酸酶生物傳感器固定于丙酮酸氧化酶上用于測定植酸酶活性，制備的植酸酶生物傳感器線性范圍0.5～6.0 U/mL，檢測限達到0.002 mmol。生物傳感器法具有線性范圍大、靈敏、操作簡便、快速、結果準確、重復性好、抗干擾能力強等優點，適合于植酸酶活性檢測.

3 總結及展望

綜上所述，目前植酸酶的測定方法有基于分光光度測定的鉬黃法、鉬藍法、近紅外光譜法，以及近年來新建立的瓊脂平板法、高效液相色譜法、酶聯免疫吸附法和生物傳感器法。分光光度測定法對設備要求相對較低，能在基層實驗室和企業開展，目前發展的比較成熟，應用廣泛；高效液相色譜法對設備要求相對較高，普通實驗室不能開展；生物傳感器法靈敏度高，但是作為一項新技術新方法未能成為廣泛普及的常規分析方法；綜合各種方法的優缺點，分光光度法中的鉬黃法是目前科研機構、酶制劑企業等的常規分析方法。植酸酶在飼料工業、食品添加劑、醫藥工業等行業有著廣泛的應用，相信隨著科學技術的不斷發展，新的植酸酶測定底物的發現，新技術和新方法研究的深入，簡便、高靈敏度、低成本、穩定性和重復率高的植酸酶活性測定方法可能被開發并應用。

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