缺血性中風動物模型研究現狀

屈會化，趙琰，盧建秋，王慶國

(北京中醫藥大學，北京 100029)

綜述·進展

缺血性中風動物模型研究現狀

屈會化，趙琰，盧建秋，王慶國

(北京中醫藥大學，北京 100029)

利用實驗動物或細胞模型完全模擬人類的中風十分困難，動物模型與臨床的擬合具有重要意義。本文對目前缺血性中風動物模型研究中的實驗動物選擇、模型評價標準及造模方法，以及主要局灶缺血模型的優缺點進行述評，為缺血性中風的基礎和應用研究選擇合適的實驗動物模型提供參考。

缺血性中風;動物模型;大腦中動脈閉塞

缺血性中風是由大腦主動脈或其分支血栓形成，或內栓子阻塞引起，且多為大腦中動脈(MCA)栓塞。利用實驗動物或細胞模型完全模擬人類的中風十分困難，過去二十年，經動物模型研究證明有效的700多種藥物中，除一種新自由基消減劑(NXY－059)外，其余全都未能在三期臨床得到陽性結果，從而無法證明其有效性，這使研究人員更認識到動物模型與臨床擬合的重要意義。本文對目前缺血性中風動物模型的研究現狀進行述評。

1 實驗動物的選擇

在腦缺血基礎與新藥研發工作中，選擇恰當的動物模型是非常重要的。缺血性中風動物模型中使用的實驗動物有兩大類:即靈長類和嚙齒類。對于中風的生理病理的了解，最初來源于中風患者。因此，靈長類動物對中風的基礎研究具有重要作用。與人類相似的多腦回靈長類動物種屬(如獼猴)，在行為和感覺運動整合方面與人類有密切的相似性，是中風基礎研究、探索性研究和臨床前評價的最佳動物模型。利用非人靈長類動物制備模型，已有了幾十年的經驗積累，如狒狒。1999年國際中風治療學術產業圓桌會議(STAIR會議)提出，藥物一旦用小動物做出陽性結果，應該在較高的物種進行驗證，然后才能開始臨床試驗［1］。最近報道，利用狨猴模型發現了神經保護藥物氯美噻唑。國內也有學者采用光化學法成功造成樹鼩局部腦缺血模型［2］，其造模方法亦被多人借鑒采納。但是，到目前為止，尚無標準化的、被廣泛接受的靈長類動物中風模型。

與靈長類較大的動物相比，嚙齒類動物模型，如大鼠和小鼠，具有價格便宜、來源充足、品種純化、制作模型方法簡單、存活率高、腦血管解剖和生理較接近于人類、易于監測生理參數，腦標本制作容易等多面的優勢［3－5］，也符合1999年STAIR會議有關腦缺血動物模型研究的建議，廣泛用于腦缺血及缺血再灌注模型，在研究工作中發揮著不可替代的作用［1］。但是嚙齒類動物的大腦與人和非人靈長類動物的大腦存在差異，對于相同的缺血損傷的反應可能不同。如何將動物的給藥方案擴大到人體一直是個難題，包括給藥劑量和療程。例如嚙齒類動物模型在中風后的第一周就可恢復，而人類中風后恢復需要較長的時間，可能需要幾個月。給藥劑量也存在同樣的問題。一些全身給藥的藥物可根據體重進行校正，而一些蛋白質和生長因子類藥物，必須腦內注射給藥，可根據大腦表面積或體積進行推算。如果沒有靈長類動物模型，以及相應的過渡步驟，從嚙齒類動物向人體轉換將很困難。

2 模型評價標準與造模方法

由于病因不同、持續時間長短不一、梗死位置的變化、缺血嚴重程度的差異，以及并發的其他系統性疾病的不同，造成了中風臨床癥狀的多樣性。中風臨床表現的多樣性和復雜性，使得利用實驗動物或細胞模型完全模擬人類的中風，是非常困難的。建立一個完全理想的缺血性腦中風模型，幾乎是不可能的。因此，選擇動物中風模型，最重要的是該模型與中風臨床表現的匹配度是多少。應該基本符合以下標準［6］:①缺血過程和病理生理反應與人類中風相似;②缺血性病灶大小重現性強;③建模的技術相對容易的，創傷小;④可以監測生理變量，并可維持在正常范圍內;⑤可方便獲取腦樣品，進行病理組織學，生物化學和分子生物學研究;⑥費用合理。

缺血性中風動物模型分為局灶性腦缺血模型和全腦缺血模型兩大類。全腦缺血模型(global ischemia)的組織病理學和所觀察到的行為障礙顯著不同，重現性差。目前基礎研究中主要采用局灶性腦缺血模型。局灶性腦缺血模型又分為永久性和暫時性缺血模型兩種。無論是永久性還是暫時性缺血，缺血性病灶大小差異都很大，而超過3 h的局部腦缺血是不可逆的［7］。這種差異直接影響藥物的評價結果。永久中風模型用來研究沒有再灌注作用的腦缺血，而暫時性腦缺血模型的閉塞動脈再灌模型，所產生的后果(即再灌注損傷)非常接近人類中風缺血部位再灌注，用于較系統地研究缺血性中風發生后的病理變化、藥物的作用機理，以及研制開發新的治療方法，是目前使用最為廣泛的動物模型。

目前局灶性大腦中動脈缺血模型的制備方法包括:①開顱機械閉塞法;②光化學誘導血栓形成法;③微栓子栓塞阻斷法;④內皮素－1灌注誘導血管收縮法;⑤化學刺激誘導血栓性閉塞法;⑥血管內線栓阻斷法等。其中以血管內線栓阻斷法應用最為廣泛。無論使用何種動物，采用何種方法，如何減少組間、個體內差異，都是評價模型成功與否的關鍵。主要的局灶性腦缺血模型制備方法及其優缺點介紹如下:

3 局灶性腦缺血模型

3.1 大腦中動脈電凝阻斷模型

通過將雄性SD大鼠小顱窗暴露大腦中動脈起始部，在大腦中動脈靠近頸內動脈處將其電凝阻斷，造成供應區缺血。為常用的永久性局灶性腦缺血模型。缺血成功率高，重復性好;但手術較復雜，且須開顱，破壞了顱腔完整性，如操作不當，可直接損傷腦組織。理論上可制成再灌注模型，但實際操作較困難［8］。

3.2 大腦中動脈線栓法再灌注模型

Koizumi［9］首次描述了線栓法阻塞大鼠大腦中動脈，將尼龍線自雄性SD大鼠的頸外動脈插入，然后將線引入頸內動脈，使其穿過大腦中動脈起始部，阻斷大腦中動脈，造成大腦中動脈供應區血流中斷，導致局灶性缺血。缺血一定時間后，將栓線慢慢抽出，恢復血流進行再灌注。此法誘發的缺血再灌注和永久性缺血性損傷程度有所差別，永久性缺血后梗死體積較短暫性缺血要大。本法無需開顱避免了手術操作對腦組織的直接刺激作用。方法簡單易行，適于對再灌注損傷的病理生理機制研究。目前該法已逐漸取代開顱法而成為最流行的方法。優點是無需開顱，屬相對非侵入的方法。缺點是需要一定的手術技巧，在以往復雜的操作中常出現動物死亡率高、腦出血或蛛網膜下腔出血、梗死大小不衡定等情況。另外個體差異較大，死亡率高。

Longa［10］和Belayev等［11，12］發現模型的可重復性和面積似乎受到許多具體因素影響，如栓線直徑(3.0或4.0線)，栓頭涂層(硅酮或多聚賴氨酸)，栓線插入深度等，與梗死體積和神經功能評分直接相關，并對Koizumi的制備方法進行了改進。目前多數文獻中，采用Longa提出的MCAO的制備方法。因此，尋找一種內在性質均一，具有一定硬度和彈性的栓線，是進一步提高線栓法大鼠MCA局灶性腦缺血模型成功率的關鍵。

線栓法不利之處包括:①血管破裂和隨后蛛網膜下腔出血;②體溫過高;③不適當的大腦中動脈阻塞。栓線的有機硅涂層和激光多普勒引導下插線可以減少蛛網膜下腔出血的發生。自發高熱的產生，被認為發生在大多數動物大腦中動脈阻塞持續2h或更長時間，是與下丘腦損傷有關。

我們在Longa法的基礎上進行了改進，使得制作方法簡便，提高了造模的成功率和可重復性，制成穩定均一的MCAO模型［13］。具體方法為大鼠麻醉后，分離頸總動脈(CCA)和頸外動脈(ECA)，將鼠頭沿長軸方向扭轉向左側45°，拉直ECA與頸內動脈(ICA)的夾角。使用頭端3 mm硅膠包埋制成0.26～0.3 mm膨大的線栓，插入自CCA與ICA分叉點18 mm。術后2 h進行神經功能評分，均為2分，造模均一性好;術后20 h行TTC染色，示大鼠大腦中動脈(MCA)皮層分布區產生梗死灶，梗死比為(19.066±1.556)%，水腫比為(1.031±0.024)。造模成功率為93.75%，死亡率為6.25%(2/30，尸檢結果顯示蛛網膜下腔出血)。

線栓法MCAO模型的制備方法，也適用于小鼠［14，15］，如轉基因和基因敲除小鼠突變體［16］;Kong等［17］在非鼠動物也成功地制備了MCAO模型，如兔;另外探討非人靈長類動物的MCAO模型的制備方法也十分需要。

3.3 光化學法誘導模型

本法通過將光敏染料孟加拉紅經尾靜脈注入后，采用特定光波在顱骨表面做定向照射，形成大腦皮質區梗死［18］。注入體內的光敏染料在特定光波的作用下發生光化學反應，引起內皮細胞過氧化，釋放自由基，導致血管內皮損傷，誘發血小板聚集而形成血栓。用該法后梗死部位可任選，不限于大腦中動脈供血區;操作方便、重復性好;該模型適于研究抗血小板藥、抗血栓藥及內皮細胞保護劑。但其造成永久性閉塞，無法再灌注。此模型創傷小，動物存活率高，梗死部位及大小易于控制，適合老年卒中患者相關基因及干預治療的研究。

3.4 局灶血栓注入法

1982年Kudu等［19］將血凝塊分段并注入頸內動脈，不僅導致了顱內栓塞，而且也引起了顱外栓塞。這可能是由于血凝塊彌散到作為頸內動脈主要分支的翼突腭動脈所引起。為防止顱外栓塞，Overguarll等［20］對該模型進行了改良，結扎了翼突腭動脈、甲狀腺動脈、枕骨動脈，將血凝塊注入頸總動脈，但這些步驟并不能防止對側半球栓塞，因為凝血塊可通過Wills環到對側半球。血栓栓塞性中風模型比其他腦缺血模型更接近人類中風，大多數的人類中風是血栓栓塞引起的。另外，血栓模型具有測試溶栓劑的潛力，可更好地評估經歷了溶栓的缺血性病變，為研究聯合療法提供了可能，如溶栓劑和神經保護藥物［21］。血栓栓塞缺血的誘導最常見的是由自體血栓進入到顱外動脈達到更遠端顱內動脈。在早期血栓模型，人體血液凝塊，或懸浮的同源小血塊碎片被用來產生栓塞。

Wang等［22］改良了微栓子栓塞阻斷法，他們將導管插入頸內動脈，將不同容積的凝血酶注入微導管，在導管內制備血凝塊，然后將血凝塊注入頸總動脈，阻塞MCA，誘導產生不同體積的大腦缺血性損傷。這種方法不僅使外科手術步驟更為簡便，而且與臨床局灶性腦缺血更為接近。因為臨床上大多數患者在單純腦中風事件中很少有大腦血栓栓塞伴兩側頸總動脈阻塞。這種栓塞性腦梗死模型成功率高，手術創傷較小，但也存在不能控制再通、對側亦可能受累以及可能導致外源物質引起的炎癥反應等缺點。凝塊狀血栓栓子技術，用大腦中動脈中血小板自然形成的凝塊或者中動脈中凝血酶形成的凝塊可直接模擬人體中凝塊誘導的腦缺血。但由于栓子的隨機性，無法預測栓塞的部位和大小，側支循環的影響使組織缺血程度不一，不利于神經癥狀觀察和組織定量分析。

綜上所述，隨著實驗動物科學的不斷發展，對腦缺血動物模型從動物的選擇、模型的分類及制備方法等角度進行了多方面的探索。核心是強調缺血損傷的可控性和重現性，同時嚴格控制各種干擾因素，盡量避免其對實驗結果的影響?？傮w發展趨勢一是基礎研究中的動物小型化，基于簡便廉驗的考慮，主要以嚙齒類尤其是大鼠為主，近年來由于轉基因小鼠的出現，也需要對小鼠的各種腦缺血模型進行研究;另一趨勢是在基礎研究到臨床應用研究的過渡中，基于最大臨床模擬度的考慮，越來越需要建立標準化的、被廣泛接受的非人靈長類腦缺血動物模型?？傊鞣N腦缺血模型都有自己的優點與局限性，在研究中應用時應根據不同的情況選用最適合的方法，還需要對其進行改進，建立最利于研究的模型。

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Current Status of Research on Animal M odels of Experimental Ischem ic Stroke

QU Hui－hua，ZHAO Yan，LU Jian－qiu，WANG Qing－guo
(Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China)

It is of great importance to use animal models in research on human diseases.However，it is very difficult to establish laboratory animal models perfectly duplicating human diseases such as cerebral stroke.Thus the high similarity of animal models to clinical status is of great importance.In order to refer to more appropriate experimental animal model for basic and applied research of ischemic stroke，this article summarized research progress in research on experimental ischemic stroke models and reviewed the animal selection，evaluating standard，modeling method，major advantages and disadvantages of focal ischemic models.

Ischemic Stroke;Animal model;MCAO

R－33

A

1005－4847(2010)04－0360－04

2009－10－12

國家自然基金重大研究計劃面上項目(編號:90709051);國際科技合作項目(編號:2007DFA30730);國家“重大新藥創制”專項課題(編號:2009ZX09102－126)。

屈會化(1966－)，男，博士，研究方向:實驗動物模型。E－mail:zhaoyandr@gmail.com

王慶國。E－mail:wangqg8558@sina.com