分析基因差異表達的幾種方法

羅永華,丁兆忠

(河北滄州職業技術學院,河北滄州061001)

隨著人類和很多動物的基因組測序完成,以基因組功能研究為主要目標的后基因組時代的來臨,基因功能信息的獲取將成為基因研究的重點。基因差異表達分析是獲取基因功能信息的重要方法。高等生物大約有3～5萬個不同的基因,在每一個正常的體細胞中都含有相同的基因組拷貝,但在不同的組織細胞中僅有10%～20%的少部分基因被選擇性表達,它將最終控制生物的形態和生理過程,是調控細胞生命活動過程的核心機制。了解不同細胞或同類細胞在不同發育階段、不同生理狀態下的基因表達狀況,可為研究生命活動過程提供重要信息,對調控生物的生長發育各階段及代謝途徑具有重大的理論和實踐意義。目前常用研究基因差異表達的方法有:mRNA差異顯示技術(mRNA differential display reverse transcription PCR,DDRT-PCR),抑制消減雜交(suppression substractive hybridization,SSH),基因表達系列分析技術(serial analysis of gene expression,SAGE)和基因芯片(gene chip)。本文對這幾種方法進行了簡要的綜述和比較。

1 mRNA差異顯示技術

1992年Liang和Pardee建立了mRNA差異顯示技術[1]。根據成熟的mRNA 3′端具有poly(A)尾巴這一特性,以一系列olige(dT)12MN引物中的一種(M=A 、C 、G,N=A 、C 、G 、T),用此引物對來自兩種或兩種以上對比材料的mRNA進行反轉錄,形成cDNA,并用此引物錨定cDNA第二條鏈的3′端,用另一條隨機寡核苷酸引物與cDNA第一鏈互補進行PCR擴增。由于寡核苷酸隨機結合在cDNA的互補靶點上,來自不同mRNA擴增片段的大小是不同的,利用高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠電泳,對PCR擴增產物進行分離,并可顯示差異表達的cDNA片段。

mRNA差異顯示技術,具有起始RNA用量少(僅需0.2 μ g總RNA 作為起始材料)、簡便快速、準確、靈敏度高,可同時比較多個樣品,并可以通過PCR獲得全長,來深化分子及功能特性的研究等優點。目前已廣泛用于發育生物學、神經科學、病理學、內分泌學、植物生理等方面的研究。但也存在一些問題,如出現差別的條帶太多,電泳顯示的差異條帶不能用Northern blot完全驗證,假陽性率有時高達70%以上[2];擴增片段的分子長度較短,一般不大于600 bp;其中某些片段源自差異表達的基因,某些源自組成型表達的基因;檢測到的往往是3′端出現差異的基因,使上游的差異表達信息得不到檢測;此外還有重復性較差,不能檢測低豐度mRNA。

為了克服以上的缺點,mRNA差異顯示技術得到了許多改進:最初的DDRT-PCR其3′端為 T11 MN(M=A 、C 、G,N=A 、C 、G 、T)的錨定引物 ,有12個組合,因此要全面分析總mRNA的差異工作量巨大,且在變性膠中容易產生smear帶[3],因此改為T11M(M=A、C、G),這樣將總mRNA 分為3個亞群,這樣大大減少了DDRT-PCR的工作量,避免了smear狀態;隨機引物也由10個堿基增加到了13、18、25個等等,這樣不但可以提高重復性,避免過多的差異條帶出現,還可以盡量覆蓋所有的差異表達基因。將差異條帶利用反向Northern blot雜交驗證大大降低了假陽性[4]。此外還在RNA提取后采用DNA酶消化處理來減少DNA污染,PCR擴增條件的優化,電泳條件等方面做了一些改進。

2 抑制消減雜交

1996年,Diatchenko L等[5]建立了一種新的以PCR反應為基礎的cDNA消減雜交方法,稱為抑制消減雜交。該方法運用了雜交二極動力學原理,即高豐度單鏈cDNA在退火時產生同源雜交速度快于低豐度的單鏈cDNA,從而使原來在豐度上有差別的單鏈cDNA相對含量達到基本一致。而所謂抑制PCR,則是利用鏈內退火優先于鏈間退火的規律使非目的序列片段3′端反向重復序列在退火時產生類似發卡的互補結構,無法與引物配對,從而選擇性地抑制了非目的基因片段的擴增。這種方法克服了以往任何一種差減方法的技術限制,在差減雜交的過程中使不同豐度cDNA拷貝數差異趨于均衡,因此不同豐度的差異表達基因都能得到有效克隆。雜交雙方為Tester和Driver,首先提取待比較的兩組細胞的mRNA,反轉錄為cDNA,經限制性內切酶消化后,將分為兩份,分別接上不同的接頭,分別向兩個樣品中加入過量的,于雜交緩沖液中進行雜交反應。第一輪雜交反應完畢后,將兩個樣品混合,再加入過量變性的繼續雜交。兩輪雜交后的群體經末端補平后,用與接頭外測序列對應的一對巢式引物進行第二次PCR擴增,二次擴增的PCR產物既可直接用于構建差減cDNA文庫,又能用做雜交探針對文庫進行差示篩選,篩選出來的克隆經雜交驗證后,可進行測序分析。

SSH技術有許多優點,主要表現在以下幾個方面:基于雜交動力學原理使不同豐度的mRNA分子趨于一致,SSH克服了不同mRNA分子拷貝數目不同對雜交結果的影響,從而大大提高了差減的靈敏度。僅需一輪差減雜交,即可對差異表達的cDNA分子達到1 000多倍的富集[6],保證了低豐度mRNA的檢出。速度快,效率高,一次SSH 可以同時分離到幾十甚至幾百個差異表達的基因。陽性率可高達94%[7]。SSH技術也存在一些缺點:需要較多的起始材料,不能同時進行數個材料之間的比較,對材料的要求也較高,存在小片段缺失時也不能有效檢測。

3 基因表達系列分析技術

基因表達系列分析是Velculescu V E等[8]在1995年建立的一種快速而高效地大規模研究基因表達的方法,其主要依據兩個理論:(1)一個來自轉錄物內特定位置的一個短的寡核苷酸序列(9～11 bp),含有鑒定一個轉錄物特異性所需的足夠信息,可以作為區別轉錄物的標簽。(2)這些標簽可以通過簡單的方法串聯在一起,形成大量多聯體(concatemer),對每個克隆到載體的多聯體進行測序并應用SAGE軟件分析,可確定表達的基因種類,并根據標簽的數量來確定基因的表達豐度。

SAGE技術流程主要包括:提取mRNA,以生物素化的oligo dT為引物反轉錄合成雙鏈cDNA。錨定酶(anchoring enzyme,AE)酶切生物素標記的cDNA,如NlaIII作為錨定酶。錨定酶酶切產物通過生物素磁珠分離含有3′端poly(A)尾巴的cDNA片段。將cDNA酶切片段等分為A和B兩部分,分別與設計好的兩種連接子A或B結合。每一種接頭都含有標簽酶(tagging enzyme,TE)酶切位點序列,標簽酶是一種Ⅱ類限制酶,它能在距識別位點約2O堿基的位置切割DNA雙鏈。用標簽酶酶切產生連有接頭的短cDNA片段(約9～10堿基),即釋放cDNA標簽。連接產物A和B經標簽酶酶切后,產生的兩個含有接頭序列和標簽序列的短cDNA片段混合,進行平端連接。用接頭引物A和引物B擴增雙標簽,用錨定酶酶切擴增產物,并分離雙標簽。含有粘性末端的雙標簽連接形成含多標簽連接子,克隆并測序。測序結果采用SAGE分析軟件對標簽數據進行處理。統計原始序列中每個標簽序列、數目及其發生率,生成相應的報告和豐度指標,分析整理數據。比較SAGE文庫標簽的豐度,分析其意義。

基因表達系列分析是一種高效、快捷、低成本的研究生物基因表達水平的方法,可在整體水平對細胞或組織中的大量轉錄本同時進行分析,從而全面反映細胞或組織中的基因表達情況,同時還可進行不同組織或細胞的所有差別表達基因的比較和研究。但由于SAGE程序的復雜性,在應用過程中還存在一些問題,如平端連接的效率低和連接速率受末端DNA序列的影響明顯,測序過程中產生誤差等。這些問題在很大程度上影響了后期的統計分析結果。SAGE方法需要較多的mRNA,因此對于微量樣本受到了很大的限制,科學家對此方法做了改進,建立了多種微量的試驗方法,如micro SAGE[9]和mini SAGE[10]等。

4 基因芯片

基因芯片是指把大量核酸片段固定在載體基片上,組成密集的按序排列的探針集群,通過與標記樣品核酸雜交,雜交信號檢測,判斷靶核酸的有無或數量的一項技術。常見的芯片可分為兩大類:一種是原位合成,適用于寡核苷酸;一種是直接點樣,多用于大片段DNA,有時也適用于寡核苷酸,甚至mRNA。基因芯片技術主要包括3個方面的內容:芯片的制備、雜交、檢測。基因芯片將半導體工業的微型制造技術與分子生物學技術結合起來,通過把巨大數量的寡核苷酸、cDNA等固定在一塊面積極小的硅片、玻片或尼龍膜等基片上而構成。由于該技術同時將大量的探針固定于支持物上,所以可以一次對大量序列進行檢測和基因分析,解決了傳統的核酸印跡雜交操作復雜、自動化程度低、檢測序列數量少等缺點。具有并行性、多樣化、微型化、自動化等特點。但其價格昂貴,探針的合成和固定比較復雜,低豐度表達基因不易被檢測,還有待于改進提高。目前基因芯片在基因表達分析[11]、醫學科研與疾病診斷[12]等各領域得到了廣泛的應用。

5 展望

以上幾種方法都是目前常用的分離差異表達基因的方法,在技術操作方面都比較成熟,也有許多成功的先例。這幾種方法在畜牧獸醫領域有著廣泛的應用,如對不同發育時期、生理狀態或病理過程中基因表達進行分析,能揭示發育過程、生理活動或病理過程的分子機制分離抗病相關基因;尋找病原應答EST s,這些ESTs可作為研究機體疾病抗性主效基因的良好候選基因,通過轉基因技術可培育出抗病品種;對生產性能不同的動物進行品種間或個體間分析,尋找與生產性相關的差異表達基因,可為分子遺傳標記進行育種奠定基礎。雖然這幾種方法在技術上比較成熟,但都有其各自的優缺點,因此有著不同的應用范圍,在試驗中要根據實際情況加以利用。為了克服這幾種方法的缺點,在不斷需求改進的同時,可將其結合使用,來取長補短。例如本實驗室將mRNA差異顯示技術和微陣列技術結合使用得到了很好的結果。

[1]Liang P,Pardee A B.Diferential display of eukaryotic messenger RN A by means of the polymerase chain reaction[J].Science,1992,257:967-971.

[2]Lauren Sompayrac,Stephen Jane,Timothy C Buml,et al.Overcoming limitations of the mRNA diferential display technique[J].Nucleic Acids Res,1995,23(22):4738-4739.

[3]Shoham N G,Arad T,Rosin-Abersfeld R,et al.Differential display assay and analy sis[J].Biotechniques,1996,20(2):182-184.

[4]Sturtevant J.Applications of Differential-Display Reverse T ranscription-PCR to MolecularPathogenesis and Medical Mycology[J].Clin Microbiol Rev,2000,13(3):408-427.

[5]Diatchenko L,Lau Y F,Campbell A P,et al.Suppression subtractive hybridization:a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(12):6025-6030.

[6]Tchernitsa O I,Zuber J,Sers C,et al.Gene expression profiling of fibroblasts resistant toward oncogene-mediated transformation reveals preferential transcription of negative growth regulators[J].Oneogene,1999,18(39):5448-5454.

[7]Siebert P D,Chenchik A,Kellogg D E,et al.An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA[J].Nucleic Acids Res,1995,23(6):1087-1088.

[8]Velculescu V E,Zhang L,Vogelstein B,et al.Serial analysis of gene ex pression[J].Science,1995,270(5235):484-487.

[9]Datson N A,van der Perk-de Jong J,van den Berg M P,et al.MicroSAGE:a modified procedure for serial analysis of gene expression in limited amounts of tissue[J].Nucleic Acids Res,1999,27(5):1300-1307.

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[12]Kan T,Shimada Y,Sato F,et al.Gene ex pression profiling in human esophageal cancers using cDNA microarray[J].Biocherm Biophys Res Commun,2001,286(4):792-801.