凝乳酶的研究進展

朱仁俊，石振興，甘伯中，胡永金

（1.云南農業大學 食品科技學院，昆明 650201；2.甘肅農業大學 食品與科學技術學院，蘭州 730070）

凝乳酶的研究進展

朱仁俊1，石振興1，甘伯中2，胡永金1

（1.云南農業大學 食品科技學院，昆明 650201；2.甘肅農業大學 食品與科學技術學院，蘭州 730070）

介紹了凝乳酶的來源結構、理化特性及凝乳機理，對提高微生物源凝乳酶的活力、產量的研究進展及未來凝乳酶研究領域的開發進行了綜述，并對其應用前景和開發進行展望。

凝乳酶；干酪；凝乳活力；蛋白分解力

0 引 言

凝乳酶是干酪生產中使乳液凝固的關鍵性酶。它對干酪的質構形成及特有風味的形成有非常重要的作用[1]。目前國際市場上凝乳酶中動物來源的約占70%，微生物的占30%，植物的不到1%，雖然動物凝乳酶凝活力與蛋白水解能力的比值高，但是動物生長緩慢且價格昂貴；植物凝乳酶蛋白水解能力強，其生產也受時間、地域等條件制約，利用微生物生產凝乳酶成本低，生產能力可以不受限制地擴大，國外一些公司早已利用改良菌種生產出高活力的凝乳酶，創造了巨大的經濟效益。我國自80年代末開展了凝乳酶的研究，但目前，國內大部分凝乳酶仍依賴于進口。當前優先發展的高科技產業化重點領域中，凝乳酶被列為我國重點開發的酶制劑之一[3]。

1 凝乳酶的來源

1.1 動物源凝乳酶

動物性凝乳酶主要是胃蛋白酶。直到20世紀末，人們一直使用小牛的皺胃進行凝乳酶的加工，但以宰殺小牛獲得凝乳酶無法滿足工業生產的需要，而且成本較高，為此，人們開發了多種皺胃酶的替代品。除可在小牛胃中提取凝乳酶外，豬、羊、狗的胃中也可以提取凝乳酶[4]。張富新等[5]研究了不同因素對羔羊皺胃酶凝乳活性的影響。但羔羊皺胃酶凝乳性較低，影響了它的使用價值。劉文宗等[6]實驗研究證明用乳豬胃酶替代小牛皺胃酶是可行的，且效果不錯。水生動物中也能提取凝乳酶制劑,如鱉魚能以酶原的形式分泌酸性蛋白酶，其胃粘液中的蛋白酶具有凝乳活性[7]。Haard[8]從海豹的胃和胃粘液中提取一種蛋白酶，這種酶在pH值為6.0～6.8范圍內有很好的凝乳活性，制造出的Cheddar干酪風味正常，是一種很有潛力的皺胃酶替代品。Tavares等人[9]報道：從金槍魚胃黏膜中提取出來的粗胃蛋白酶可作為凝乳酶的代用品，該酶來源廣泛，因此價格低廉，是一種較好的凝乳酶代用品。盡管如此，但由于動物資源不如植物和微生物豐富，各國學者紛紛將研究目標轉向植物和微生物源凝乳酶。

1.2 植物源凝乳酶酶

許多植物來源的蛋白酶具有凝乳的性質，植物凝乳酶來源廣泛，己知木瓜、無花果、菠蘿、南瓜、合歡樹、銀杏等植物中都含有能使乳凝固的蛋白酶。其中對無花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、波蘿酶研究最為廣泛。張富新等人[10]對無花果蛋白酶的凝乳特性進行了研究，發現其有較好的凝乳性。但許多研究表明植物性凝乳酶蛋白水解活力高，在加工干酪時影響其風味和產量，并且受時間、地域、生長周期長等條件限制，難以發展[11]。

1.3 微生物源凝乳酶

微生物凝乳酶是目前最有前途的發展方向。微生物生長周期短，產量大，受氣候、地域、時間限制小，用其生產凝乳酶成本較低、酶提取方便、經濟效益高[11]。微生物凝乳酶可以劃分為霉菌、細菌、擔子菌3種來源的制劑。生產中應用最多的是來源于霉菌的凝乳酶，其代表物是從微小霉菌（mucorpusillus）中分離出來的凝乳酶，分子質量為29800 u，凝乳的最適溫度為56℃，蛋白分解力比皺胃酶強，但較其他蛋白酶的蛋白分解能力弱，對牛乳的凝固作用較強[3]。郭光遠等[12]人從2127株放線菌篩選的初步結果表明，62%的高溫鏈霉菌菌株產生凝乳酶，產酶活力較高（100U／mL）的菌株占5.2%：中溫鏈霉菌有11.3%的菌株產酶，活性較高的占2.2%。小單孢菌、諾卡氏菌、馬拉杜放線菌、高溫放線菌也都有產凝乳酶的活力。對215株真菌的篩選結果表明，有9.8%的菌株產生凝乳酶。細菌有8.8%的菌株產凝乳酶，活性較高的占3.1%[11]。孫健等[13]從17株產凝乳酶的霉菌中初篩到產酶最較高的總狀毛霉（Mucor racemosus）菌株。劉振民等[14]發現酒藥中的主要菌系-根霉，具有一定的產凝乳酶活力，可作為凝乳酶的潛在生產菌。目前微生物凝乳酶應用最多的是微小毛霉（Mucor pusillus）產生的凝乳酶。微小毛霉凝乳酶的蛋白分解力比皺胃強，但比其它的蛋白酶蛋白分解力弱，對牛乳凝固力強。錢世均等[15]人從19株毛霉中篩選出一株微小毛霉菌株，并對其產生的凝乳酶進行了純化和酶學性質的研究。

2 凝乳酶結構、理化特性及凝乳機理

2.1 凝乳酶的結構及理化特性

凝乳酶原分子量為40，777u（365個氨基酸），在酸性條件下N末端的42個氨基酸能夠自我剪切掉，形成分子量為35，622 Da（323個氨基酸）有活性的成熟凝乳酶。凝乳酶蛋白為腎形，大小為49?×50?×65?。它具有酸性蛋白酶家族的類二折疊對稱的結構特點，與其他真核細胞天冬氨酸蛋白酶有高度的同源性，變異范圍在30%～60%之間。通過X線衍射研究發現：凝乳酶分子可分為由1～175氨基酸殘基組成的N端區域和由176～323氨基酸殘基組成的C端區域，兩個區域之間是一個深溝狀的活性部位[16]。凝乳酶以β片層結構為主，每個區域的β結構都由正向平行和反向平行的β折疊組成。每個部分都有一些α螺旋的短片段與β折疊相連，通常一個區域內的β折疊在另一個區域有局部相同的片段，而α螺旋則沒有。在N端區域和C端區域的分離裂溝底部發現兩個天冬氨基酸活性位點：Asp-34和Asp-216。氨基酸殘基和水分子在活性位點形成廣泛的氫鍵網狀結構以維持凝乳酶的類二折疊對稱結構。二硫鍵Cys-250和Cys一283對于酶的活性有重要意義，如果將這兩個二硫鍵羧基化或汞化，可使酶活性降低25%。凝乳酶等電點為pH值為4.5。干燥物活性穩定，但水溶液不穩定，水溶液的pH值約為5.8，對牛奶凝固的最適pH值為5.8，最適溫度為37-43℃，在15℃以下和55℃以上時不呈活性。幾乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚。凝乳酶以兩個等位基因A和B的其中一種形式表達，A的244位點為Asp，而B為Gly，凝乳酶A和B活性的不同歸因于Asp244的強電子活性導致的鍵親和力增加[17]。凝乳酶A對K-酪蛋白有更強的活性，但比凝乳酶B缺少穩定性。凝乳酶C是凝乳酶A的自溶產物，由凝乳酶A自行切除Asp286-Glu287-Phe288而產生C[18]。

2.2 凝乳酶的凝乳機理

凝乳酶凝乳過程可分為兩步：第一步是酶專一性地水解乳中酪蛋白多肽鏈的105～106位苯丙氨酸和甲硫氨酸之間的肽鍵，形成穩定的副酪蛋白及親水性的糖巨肽；第二步是當總的酪蛋白被水解掉約85%時，在鈣離子存在下通過在酪蛋白膠粒間形成的化學鍵形成凝塊或凝固的乳[19]。這是由于酪蛋白的穩定性在于κ-酪蛋白分子層的存在，κ-酪蛋白分子位于酪蛋白膠束表面，亞基之間以疏水鍵和膠體磷酸鈣相互作用的方式連接在一起。酪蛋白在凝乳酶的作用下，酪蛋白膠粒表面κ-酪蛋白分子層部分分解，膠粒內部的αs、β-酪蛋白失去膠體保護作用，變為副酪蛋白，而副酪蛋白在鈣離子存在下，形成不溶性凝塊。理想的凝乳酶應能迅速、專一地打開κ-酪蛋白的Phe105-Met106鍵，而水解其他肽鍵的蛋白水解能力低，即兩者的活力比值要高[11]。

3 提高微生物源凝乳酶的活力及產量的研究進展

3.1 優化培養基及培養條件

在培養產凝乳酶微生物的過程中，主要研究集中在挑選凝乳活力較高而蛋白水解活力相對較低的產酶菌株。甘伯中等[20]對微生物凝乳酶固態發酵條件的研究中發現：培養基固液比為1︰0.8，產酶最適培養基為：麩皮10 g，水8 g，硝酸銨1 g氯化鈣0.08 g；最佳產酶條件為28℃，接種量為10%，培養72 h，起始pH值為6.5，并得出微小毛霉誘變菌株HL-1可高效產凝乳酶[19]。周俊清[19]在凝乳酶優良菌株的選誘及其酶活特性的研究中發現，經誘變后的菌株UH-19液體搖瓶發酵的最佳培養基配方：鼓皮9%，乳清粉1%，CaCl2為0.2%，NaH2PO4為0.43%，無水NaCO3為0.1%（均為質量分數）。培養發酵產酶的最佳條件：種子菌齡為48 h，溫度為30℃，發酵48 h，培養液起始的pH值為7.0，搖床轉速為180 r/min。孫健等[13]對變異后的總狀毛霉R132進行了產酶最優條件的探討，發現R132株適于液體培養產生凝乳酶；對培養基有機成分進行了L9（34）的正交試驗，結果證明葡萄糖為顯著因子，麩皮次之，奶粉與豆粉顯示較弱的負效應。選出了優化的培養基配方：麩皮4%， 葡萄糖6%，NaNO30.3%，KH2PO40.05%，Mg-SO40.025%（均為質量分數）；在此培養條件下，酶活性比值有較大提高。郭光遠等[12]研究了菌株Y85一8512的發酵條件與產酶關系，認為液體種子10%的接種量發酵72 h酶活力最高。劉振民等[14]在對酒藥中凝乳酶菌株篩選及產酶條件的研究中得出：土豆汁培養基有利于酶的產生，酶活可達11.08U/mL。

3.2 誘變育種

大多數野生菌株產凝乳酶活力較低，產生的酶蛋白水解力也比較高，不適合工業化生產。因此可通過對菌株有目的地進行人工誘變，提高突變頻率，迅速獲得優良高產的菌種，從而產生巨大的經濟效益[11]。在對產凝乳酶菌株的誘變育種方面，有不少學者做了大量的研究，以獲得產凝乳酶活力高和蛋白水解力低的菌株。郭光遠等[12]對56株酶活力超過l00 u/ml的菌株進行反復對比后，選定一株毛霉（Mucor sp.）代號Y85-8512和一株芽抱桿菌（Bacillus sp.）代號Y85-8501作出發菌，經誘變選育得到酶活比值高且凝乳活力分別可達到5000 U/g和l0000 U/g的穩定高產菌株。周俊清等[19]在凝乳酶優良菌株的選誘及其酶活特性的研究中以細菌BZ-17為出發菌株，通過誘變篩選出一株變異菌株UH-9，該菌株所產酶與出發菌株相比，凝乳活力提高279.32%，蛋白水解活力降低了80.88%，并經過5代遺傳穩定性試驗表明該菌株所產酶的活力可保持在穩定的水平。矯慶華等[21]人研究認為，微小毛霉602在含有50%～60%麩皮的半固體培養基中，起始pH值為5.0～6.7，28℃條件下培養96 h，所產生的酶具有較高凝乳活性和較低的蛋白水解力，補加葡萄糖、蔗糖、硫酸餒、乳清粉均對產酶無顯著的影響。利用誘變育種，可獲得產高效凝乳酶的菌株，但此法隨機性和盲目性較大，工作也較繁鎖，結果難以預測，若結合現代統計分析軟件和技術，合理設計實驗，將會大量減少工作量，取得較理想的結果。

3.3 基因工程育種

基因工程育種是把某一生物體的遺傳物質在體外經限制性內切酶與連接酶剪接，與一定載體（質粒、病毒等）相連接，構成重組DNA分子，通過一定的方法轉入另一生物體（受體）細胞中，使被導入的外源DNA片段在受體中表達，并穩定遺傳[19]。基因工程育種是當今最重要也是人們研究最多的高新生物技術之一，與誘變育種技術相比，它是人們在生物學指導下可預先設計和控制的育種新技術使試驗向預定的方向進行，減少了傳統育種的隨機性和盲目性[22]。克氏乳酸菌具有良好的發酵屬性，Madzak等[23]用XPR2啟動子調控前凝乳酶基因的表達，其活性凝乳酶的產量明顯高于由Y脂肪分解酶啟動子調控的凝乳酶表達的產量。霉菌中比較適合轉入凝乳酶基因的霉菌是米黑氏毛霉菌，不斯理毛霉菌，寄生毛霉菌和黑曲霉。Tsuchiya等[24]發現用米曲霉作為牛凝乳酶源表達載體具有高效表達異源性蛋白質的特點。Tsuchiya構建了PEG31、PFG33兩種質粒：以Cla-A作啟動子的PFG31質粒帶有Gla-A-1-633Aaa基因， 缺C端9個Aa基因PFG33質粒帶Gla-A-1-511Aa基因，缺糖結合位點，從這兩種質粒在米曲霉中表達情況的研究中發現F316菌株 （含PFG33質粒）產凝乳酶原量最高。Cardoza和Gutierrez構建了兩種重組質粒，一種將3-磷酸甘油醛脫氫酶（gpdA）調控基因與前凝乳酶源基因構建在一起，另一種將曲霉菌胃蛋白酶B（pepB）調控基因與凝乳酶源基因構建在一起，將它們分別轉化黑曲霉菌（A.awamori）,發現黑曲霉的兩種質粒轉化子都能分泌牛凝乳酶，而且無論是酶的活性還是抗原性都是一致的[25]。

用大腸桿菌生產重組凝乳酶，通過質粒構建、加強質粒穩定性、選擇合適菌株、改善培養基成分和生長溫度等來提高產量.已經取得了很多進展。Mohanty等[17]分別將Lac調控基因和Trp-beta調控基因與前凝乳酶基因構建在一起，使凝乳酶能在大腸桿菌中表達，但重組蛋白以細胞內包含體形式存在，需在下游操作中進行變形、復性的處理。王志林等[26]通過設計一對特異性引物，采用RT-PCR技術從未成熟的木瓜組織中擴增得到木瓜凝乳酶基因，并將其重組到pPIC9K載體中，轉化大腸桿菌并篩選陽性克隆，得到的基因為木瓜凝乳酶基因。

3.4 蛋白質工程育種

蛋白質工程這一技術是編碼蛋白質的基因DNA堿基排列順序或蛋白質的氨基酸序列順序或蛋白質的氨基酸序列完全清楚的基礎上進行的。天然的凝乳酶由于具有凝乳活力低，蛋白水解能力強等一些缺陷，在生產實踐上的應用受到很大制約。因此，利用蛋白質工程對凝乳酶進行定向的分子改造，研究凝乳酶分子中特定氨基酸殘基與其功能之間的關系，通過基因定點突變技術可以實現酶分子中特定氨基酸殘基的替換，通過替換前后兩種酶蛋白質的比較就可以進一步闡明凝乳酶分子結構與其特定性質之間的確切關系，繼而改善其相應的酶學性質。目前對凝乳酶結構方面的研究主要是復性過程中二硫鍵的重折疊問題。牛凝乳酶在復性過程中由于二硫鍵的正確折疊率、配對率較低，導致凝乳酶的表達率低。因此，設想通過蛋白質工程將牛凝乳酶的二硫鍵減少，以期提高復性率。Huang K等人[27]發現凝乳酶中Cys250-Cys283鍵是決定必需的，Cys45-Cys50是可取代的[28]，而Cys206-Cys210對凝乳酶的正確折疊不是必需的[29]。

弄清每對二硫鍵的功能與性質后，就可以利用蛋白質工程對凝乳酶在不改變其原有性質的基礎上提高復性率，增加表達產量。同理，研究清楚凝乳酶蛋白質結構組成及一些酶學性質后，可對其進行結構改造，提高凝乳活力，降低蛋白水解力。然而這些工作還處于起步階段,還有很多工作要做。隨著研究工作的深入，相信高效的凝乳酶將有一個良好的發展前景[30]。

4 開發與展望

隨著我國畜牧業的迅速發展，奶酪以其豐富的營養成分，并作為牛奶一種長期有效的保存方法，值得大力推廣。雖然人們己經嘗試了使用各種方法，提高凝乳酶活力，降低蛋白水解力并且取得了很大進步，但是仍有很多問題沒有解決，尚需科學工作者付出艱辛的努力，不斷探索、發現更好的方法和找到更好的途徑獲得高效的凝乳酶[11]。可以通過篩選出更多優良菌種，用該菌株生產的凝乳酶應有效凝乳而水解活力不大,并且用其制作的奶酪質地和風味易被消費者接受；積極利用現代生物技術對產酶菌種進行改良，開發新型酶，以及酶的反應技術，酶的應用等，使之更有利于食品工業的發展。對影響凝乳酶原表達的因素開展進一步的研究，以求發現更多更好的載體、宿主細胞，進而不斷提高其表達率；利用固定化酶技術不失為解決凝乳酶短缺的有效途徑。

為了使我國奶酪生產能順利發展，解決凝乳酶的供應矛盾，對凝乳酶的研究及開發已成為乳品業當務之急，這方面的研究必然成為今后奶酪工業化生產中一個研究的熱點和難點，而且也將給社會帶來巨大的經濟效益。

[1]蘇光宇.影響凝乳酶活性的研究[J].科技與經濟，2006,（11）：120-121.

[2]居乃琥.酶工程研究和酶工程產業的新進展[J].食品與發酵工業，2000，26（4）：38-43.

[3]張和平，張烈兵.現代乳品工業化手冊[M].北京：中國輕工業出版社，2005.

[4]張紅梅，劉鐘濱.凝乳酶的研究進展[J].同濟大學學報，2004,25（3）：254-255.

[5]張富新，楊寶進.植物凝乳酶凝乳特性的研究[J].黃牛雜志，1997（1）：27-29.

[6]劉文宗,蔣敏，何曉霞，等.干酪凝乳酶代用品研究[J].四川畜牧獸醫學院學報，2001,15（2）：23-27.

[7]張富新;顧熟琴.不同凝乳酶在干酪生產中應用效果的研究[J].食品工業科技，2003,24（7）：20-22.

[8]HARD N F.A Review of Proteolytic Enzymes from Marine Organisms and Their Application in the Food Industry[J].Journal of Aquatic Food Product Technology，1992,1（1）：17-35.

[9]TAVARES J E P,BAPTISTA J A B B,MARCONE M F.Milk-Coagulating Enzymes of Tuna Fish Waste as a Rennet Substitute[J].International Journal of Food Science and Nutrition，1997,48（3）：169-176.

[10]張富新，顧熟琴.不同凝乳酶在干酪生產中應用效果的研究[J].食品工業科技，2003,24（7）：20-22.

[11]周俊清.產高效凝乳酶菌株獲得方法的探討[J].食品科學，2005，26（3）：253-256.

[12]郭光遠，姜成林.微生物凝乳酶的研究I：菌株的篩選、發酵、制備及毒性[J].微生物學通報，1988，15（5）：207-210.

[13]孫健，宋曉紅.總狀毛霉凝乳酶的研制及初步應用[J].微生物學通報，1994,21（1）：5-10.

[14]劉振民，劉輝.酒藥中凝乳酶菌株篩選及產酶條件研究[J].食品與發酵工業，2001，27（5）：8-11.

[15]錢世均，張純青.微小毛霉凝乳酶的純化和性質[J].微生物學報，1989,29（4）：272-277.

[16]MATTHEW RG,VENUGOPAL D,MOHAMMED B,et al.A2.3? Resolution Structure of Chyosin Complexed with a Redueed Bond Inhibitor Shows That the Active Site β-hairpin Flap Is Rearranged when Compared with the Native Crystal Structure[J].Protion Engineering,1998,11（10）：833-840.

[17]MOHANTY A K,MUKBOPADHYAY U K,GROVER S,et al.Bovine Chymosin：Productionby rDNA Technology and Application in Cheese Manufacture[J].Biotechnol Adv,1999,17（2-3）：205-217.

[18]KAGEYAMA T.Pepsinogens，Progastficsins，and Prochymosins：Structure，Function，Evolution，and Development[J].Cell Mol Life Sci，2002，59（2）：288-306.

[19]周俊清.凝乳酶優良菌株的選誘及其酶活特性的研究[D].湖南農業大學,2005.

[20]甘伯中，高維東，丁福軍,等.微生物凝乳酶固體發酵條件的研究[J].食品工業科技，2008,29（4）：196-198.

[21]矯慶華，錢世均，孟廣震.微小毛霉凝乳酶的生物合成和性質的研究[J].微生物學報，1992,32（1）：30-35.

[22]張建忠，徐筆鋒，胡斌斌.基因工程凝乳酶的研究開發[J].食品研究與開發，1998，19（3）：43-45.

[23]MADZAK C,TTETON B,BLANCHIN R S,et al.Strong Hybrid Promoters and Integrative Expression/secretion Vectors for Quasi-ConstitutiveExpressionofHeterologousProteinsintheYeast Yarrowia Lipolytica[J].J Mol Microbiol Biotechnol,2000,2（2）：207-216.

[24]TSUCHIYA K,NAGASHIMA T,YAMAMOTO Y,et al.High level secretion of calf chymosin using a glucoamylase-prochymosin fusion fene in Aspergillus oryzae[J].Biosci Biotechnol Biochem,1994,58：895-899.

[25]CARDOZA R E,GUTIERREZ S,COLINA A,et al.Expression of a Synthetic Copy of the Bovine Chymosin Gene in Aspergillus Awamori from Constitutive and pH-regulated Promoters and Secretion Using Two Different Pre-pro Sequences[J].Biotechnol Bioeng,2003,83（3）：249-259.

[26]王志林，趙樹進，吳新榮，等.木瓜凝乳酶基因的克隆及序列分析[J].激光生物學報，2003（1）：43-46.

[27]HUANG K,ZHANG Z Z,LIU N J,et al.Functional Implication of Disulfide Bond,Cys250-Cys283，in Bovine Chymosin[J].Biochem Biophys Res Commun，1992,187：692-696.

[28]楊海粟，吳華，劉德富.牛凝乳酶二硫鍵功能的研究-Cys45的定位突變[J].北京聯合大學學報，1994,8（1）：33-39.

[29]唐兵.缺失Cys45-Cys50二硫鍵的三種突變體凝乳酶原復性的比較研究[J].武漢大學學報（自然科學版），1997,43（4）：527-531.

[30]戴四發，黎觀紅，吳石金.現代工業微生物育種技術研究進展[J].微生物學雜志，2000,20（2）：48-53.

Rearch advancement of Chymosin

ZHU Re-jun1,SHI Zheng-xing1,GAN Bo-zhong2,HU Yong-jin1
（1.Yunnan Agricultural University，College of Food Science and Technology,Kunming 650201,China；2.Gansu Agricultural University，College of Food Science and Technology,Lanzhou 730070，China）

This article describes the resource,structural composition,general characteristics,and mechanism of chymosin and overview research progression about research and prospect of chymosin in future and how to enhance clotting milk activity and production of the microbial source chymosin.Furthermore,the prospect of chymosin application was also predicted.

Chymosin;cheese;clotting milk activity;protein decomposition power

TS252.1

B

1001-2230（2010）01-0039-04

2009-08-24

甘肅省農業生物技術專項 （GNSW-2006-14），甘肅省科技重大專項 （0702NKDA034）。

朱仁俊（1968-），男，副教授，主要從事食品科學與工程的研究。

胡永金