供者凋亡細胞靜脈輸注在異種肝移植中所產生體液免疫機理

張業偉,孫 磊,嚴棟梁,劉允怡,王太洪

(1.南京醫科大學附屬江蘇省腫瘤醫院普外科,江蘇南京,210009;2.南通大學第二附屬醫院普外科,江蘇南通,226300;3.香港中文大學醫學院附屬香港威爾斯親王醫院外科學系)

供者器官來源嚴重不足深深阻礙了和困擾著器官手術的推廣和應用。隨著對異種移植的興趣和深入研究,跨物種的異種移植已經成為醫學領域的熱點。異種1移植除了解決供移植器官來源的問題外,還可能避免人類病毒的感染(如HIV和肝炎病毒),因為動物組織對人感染的病毒不感染,異種移植有可能今后用于治療新的傳染病,如心肌炎、病毒性肺炎或腎炎等。

本研究分別以正常和經全身預處理(RIC)的貴州香豬為供者、中國獼猴為受體,建立異種肝移植模型。探討異種肝移植術后超急性排斥反應發生的機制;及探討受體靜脈輸注異種供體來源凋亡細胞能否抑制異種移植免疫排斥反應及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康貴州香豬(雌雄不限,14.5～24.5 kg,由太倉育種豬廠提供)作為供體。中國獼猴(1月大,1～1.5 kg,雄性,由蘇州西山中科有限公司提供)作為受體。飼養條件符合無特定病原(SPF)動物飼養標準。術前禁食8 h、自由飲水,術后不給免疫抑制劑及抗生素,予單籠飼養,自由攝食、飲水。

1.2 實驗分組

實驗選用近交系的中國獼猴為受者和貴州香豬為供者,進行原位肝臟移植。受者獼猴隨機分為A、B、C組,A組為正常對照組,n=6;B組為實驗對照組,n=28,在接受RIC之后,再接受供者貴州香豬的異種異基因骨髓(BM)靜脈輸注;C組為實驗組,n=36,在接受RIC之后,再接受供者貴州香豬的BM和凋亡細胞同時靜脈輸注。

手術后每日觀察大體情況,生存時間、統計生存率。在術后規定時間點(4、7 d)取外周血,第14天犧牲動物獲取外周血和肝臟及脾臟保存以備檢測。

1.3 凋亡脾細胞的制備

取3×106脾細胞,離心(1500 rpm/min,10m in),加入Hanks液,混勻后均勻點于無菌6孔板中,37℃下置于紫外線燈下照射,光源距離樣品垂直距離40 cm,波長320 nm,照射時間為20min,吸取細胞懸液,離心,去上清,加入完全培養基,37℃、5%C02培養箱中培育。

1.4 肝功能測定

取各組肝移植術后外周血分離血清,通過自動生化分析儀(UVIDEC-77,Japan)測定丙氨酸轉氨酶(ALT)、總膽紅素(TB)值。

1.5 T細胞亞群分析

取未刺激的外周全血50μL并分別加入9μL PerCp-抗猴CD3mAb(購自 BeckmanCoul公司),FITC-抗猴CD4 mAb(購自BeckmanCoul公司)和APC-Cy7-抗猴CD8 mAb(購自BeckmanCoul公司),于4℃下避光孵育30 min后溶血,用PBS洗滌重懸后用FACSCanto(Beckm an-Coul,USA)檢測。采用BeckmanCoul FACSDiva軟件分析數據。

1.6 Foxp3+CD4+CD25+測定

取未刺激的外周全血50μL后加入10μL的CD4-FITC與CD25-APC cock tail(購自BeckmanCoul公司),并于4℃下避光孵育30m in以標記CD4+CD25+T細胞;經溶血洗滌后使用1 m L Fixation/Perm緩沖液穿膜45 m in,而后用洗滌緩沖液洗滌后加人1μL正常人血清于4℃封閉15min,之后直接加人10μL PE-抗猴Foxp3 mAb(購自 Beckm anCoul公司)或加人 10μL PE-IgG2b做為同型對照(試劑盒提供)于4℃避光孵育30 min。經洗滌緩沖液洗滌2次后用300 μL flow cytimetry staining buffer重懸并上FACSCanto檢測。采用BeckmanCoul FACSDiva軟件分析數據,計算CD4+CD25+細胞中Foxp3+細胞百分率。

1.7 GITR表達分析

用RPM l 1640培養液按1∶1體積比稀釋采集的肝素鈉抗凝全血并充分混勻,而后加人佛波酯(167μg/L)和離子霉素(1 mg/L)在50 m L/L CO2細胞培養箱中37℃下培養6 h。刺激培養后的全血用于GITR檢測。Human regulatory T cell Staining kit(購自eBioscience公司),RPM l 1640培養基干粉(購自GIBCO公司),佛波醋和離子霉素(購自sigma公司),小牛血清(購自武漢三利生物技術公司)。取刺激培養后的50μL全血并分別加入 10 μL PerCp-CD3、5 μL APC-Cy7-CD8于4℃下避光孵育30 min。之后溶血并用PBS洗滌1次,用殘留的PBS重懸細胞后再加入10μLPE-抗猴G lTRmAb(購自R&D公司)或10μLPE-IgG1(購自BeckmanCoul公司)作為同型對照于4℃下避光孵育 45 m in,洗滌后用FACSCanto檢測。采用BeckmanCoul FACSDiva軟件分析數據。

1.8 統計學處理

數據用統計軟件SPSS 13.0進行統計學處理。計量資料以均數±標準差表示,采用完全隨機方差分析。生存分析用Kaplan-Meier法作生存曲線,并用Log Rank法進行顯著性檢驗,以P=0.05為顯著性檢驗水準。

2 結 果

2.1 各組猴肝移植術后存活期比較

Kaplan-Meier法生存曲線示A和C組存活期均大于100 d,兩組間無顯著差異。表明以貴州香豬為供體、中國獼猴為受體即使主要組織相容性抗原完全不同,肝臟移植后受體仍能獲得長期存活。B組因超急性排斥反應,受體獼猴存活期為3 h～16 d,平均生存時間(3±1.1)d,生存時間和生存率顯著降低,與陰性對照組和同種肝臟移植組及C組相比有顯著降低。

2.2 各組猴肝移植術后肝功能的變化

各組肝功能檢測,B、C兩組由于缺血再灌注及手術創傷引起的損害,與正常對照組相比,C組術后第4天可看到一定程度的ALT、TB升高,以后逐漸下降于術后第14天恢復正常。提示該模型術后早期出現了急性排斥反應并引起了肝損害,但宿主自身可克服排斥反應而長期生存。B組受體術后外周血血清ALT、TB值增高明顯,并持續增加,在不同時間點均明顯高于A、C 2組(見表1)。

表1 各組大鼠肝移植術后肝功能的變化

2.3 各組猴肝移植術后外周血T細胞亞群分析

FACSCanto檢測各組外周血T細胞亞群,3組間其CD3+T細胞計數的差異無統計學意義。T細胞亞群分析顯示,3組間其CD3+CD4+T細胞無明顯變化。C組術后第4天周血CD3+CD8+略有上升,CD4+/CD8+略有下降,但在術后第7、14天恢復正常并與A組相比無明顯差異,提示該模型術后早期出現了急性排斥反應并引起了肝損害,但宿主自身可克服排斥反應而長期生存。B組CD3+CD8+/%增高明顯,并持續增加,在不同時間點均明顯高于A、C兩組,但是CD4+/CD8+并持續下降,在不同時間點均明顯低于A、C兩組。受體獼猴在接受RIC之后,再接受供者貴州香豬的BM和凋亡細胞同時靜脈輸注,可有意降低受體獼猴體內T淋巴細胞中CD3+及CD8+細胞比率,抑制受體獼猴脾臟T淋巴細胞的增殖,抑制受體獼猴脾臟CTL所占比例(見表2)。

表2 各組大鼠肝移植術后外周血T細胞亞群分析

表3 各組肝移植術后外周血中Foxp3+CD4+CD25+Treg與CD4+CD25+T細胞的比例(%)

2.4 各組猴肝移植術后外周血Foxp3+CD4+CD25+Treg和CD4+CD25+T細胞的表達

FACSCanto檢測各組外周血Foxp3+CD4+CD25+Treg,與A組相比,C組術后第4天Foxp3+CD4+CD25+Treg和CD4+CD25+調節性T細胞數量較同種肝臟移植組有所降低但與A組相比無明顯差異,而在術后7 d、14 d時明顯上升,顯著高于A組同時間的比例。B組肝術后Foxp3+CD4+CD25+Treg和CD4+CD25+調節性T細胞比例即呈現明顯下降,與顯著低于A、C組兩組同時間段的比例(見表3)。

2.5 各組猴肝移植術后外周血T細胞亞群上GITR表達分析

在獼猴的外周血中絕大多數淋巴細胞處于靜息期,未經刺激時T細胞上不能檢出明顯GITR表達,但經佛波醋和離子霉素聯合刺激培養后A組以及B組和C組T細胞上GITR表達均有增加,且B組外周血T細胞亞群上的GITR表達均顯著高于A組和C組。但在不同時間點下T細胞亞群上GITR的表達模式不同,如C組術后第4天CD3+CD4+T細胞上的GITR表達高于其在CD3+CD8+T細胞亞群上的表達,但是隨著排斥反應增強,GITR在CD3+CD4+T細胞上的表達降低,而在CD3+CD8+T細胞上表達增加 (見表4)。

表4 各組肝移植術后外周血T細胞亞群上GITR表達分析

3 討 論

在部分品系大鼠、小鼠等動物間進行同種異基因肝臟移植,即使主要組織相容性抗原完全不同也可以形成自發性移植免疫耐受[1]。本研究建立的異種肝移植模型,受體為猴、供體為豬,因為猴體內的天然抗體及補體系統和人接近,豬器官移植給靈長類,術后立即發生介導超急性排斥反應是由于受者體內預存抗體特異性識別α-半乳糖苷(Galα1-3Gal)。

本研究結果顯示:C組受體獼猴在肝臟移植后雖能夠獲得長期存活,但術后第4、7天血清ALT、TB值與B組受體猴在肝臟移植后相比均有明顯升高,但在術后14 d左右下降到正常水平并且與正常對照組無差異,經移植肝臟病理檢測無排斥反應現象發生。表明C組實驗組受體猴,在接受RIC之后,再接受供者貴州香豬的BM和凋亡細胞同時靜脈輸注。受體在術后早期階段可能經歷了排斥反應但可最終獲得自發性免疫耐受。

有研究顯示去除大鼠模型中的CD4+CD25+Treg后可以誘導自身免疫性疾病的發生和發展[2],提示CD4+CD25+Treg功能障礙在器官或/和細胞移植排斥反應的病理發生中具有重要作用[3-4]。Jiang與Demirkiran等在肝移植中等也證實CD4+CD25+調節T細胞對肝移植后形成免疫耐受抑制排斥反應有關[5-6]。通過動態監測三組受體猴肝移植術后外周血中CD3+CD4+T細胞的比例,3組間相比較無顯著差異。而CD3+CD8+T細胞比例監測的結果是,B、C組和A組相比術后第4天升高明顯,并且持續至術后7 d,但C組在術后14 d恢復正常并與A組相比無明顯差異。B組受體術后CD3+CD8+T比例增高明顯,并持續增加,在不同時間點均明顯高于A、C組,提示B組急性排斥反應時受體外周血中T細胞平衡失控。而且有報道CD3+CD8+T細胞高表達T細胞活化標志HLA-DR,其分泌的細胞因子呈Th2極化[7]。此提示B組急性排斥反應受體CD3+CD8+T細胞增殖以及功能活化明顯。大量活化的CD3+CD8+T細胞可通過其細胞毒性作用誘導靶細胞凋亡增加,當凋亡細胞數量超過體內樹突狀細胞等抗原呈遞細胞的處理能力時即會增加自身抗原的暴露而促使疾病的發生發展;通過對3組受體猴肝移植術后脾臟CTL殺傷活性檢測的結果和外周血中CD3+CD8+細胞的比例動態監測是一致。而B組受體猴體內CD3+CD8+T細胞的過度活化,則可能是Foxp3+CD4+CD25+T reg介導的免疫抑制功能的障礙和GITR提供的共刺激活化信號共同作用的結果。

Piccirillo等[8]報道CD4+CD25+Treg通過抑制IL-2的分泌以及CD25的上調表達而抑制CD3+CD8+T細胞的增殖活化。對B組和C組外周血Treg的表達分析顯示急性排斥反應組外周血Foxp3+CD4+CD25+Treg表達比例在各個時間點均明顯低于正常對照組,而C組體內Foxp3+CD4+CD25+T reg表達比例在術后第4天明顯低于正常對照組和同種肝臟移植組,并且持續至術后7 d,但在術后14 d恢復正常并與正常對照組和同種肝臟移植組相比無明顯差異,提示受體猴,異種肝移植術后急性排斥反應是因體內調節性T細胞生成障礙;而該作用的障礙使得Foxp3+CD4+CD25+Treg對CD3+CD8+T細胞的免疫抑制能力減弱,從而促使B組體內的CD3+CD8+T細胞呈現出高度的功能活性,并使其在B組外周血中的表達增加,而C組術后早期外周血中的CD3+CD8+T細胞表達也是增加。B組體內Foxp3+CD4+CD25+Treg表達的降低可能是由體內CD3+CD4+T細胞上高表達的GITR信號介導的。

Roncheti等[9]報道GITR跟信號的活化可以促使CD4+CD25+Treg向效應性+CD4+CD25+T細胞轉化,并誘導其抑制活性喪失,而GITR分子在急性排斥反應組體內CD4+CD25+T細胞上高表達。該研究結果顯示:B組外周血中CD3+CD4+T細胞上GITR表達顯著增加,同時也顯示B組外周血中CD3+CD4+T細胞和CD3+CD8+T細胞膜上GITR的表達均顯著高于正常對照組,然而B組外周血中僅CD3+CD8+T細胞表達增加,提示盡管GITR信號對T細胞具有共刺激活化作用,但是 CD3+CD8+T細胞對GITR信號的活化作用似乎更為敏感。Roncheti等[9-10]報道活化的GITR-/-T細胞較 GITR+/+T細胞更易發生由CD3信號誘導的凋亡,GITR信號的活化有助于T細胞的存活。B組外周血中CD3+CD8+T細胞上G ITR表達的增加有可能促使其長期存活,從而使得B組外周血中CD3+CD8+T細胞表達增加。G ITR信號通過其對淋巴細胞的共刺激活化作用和凋亡抑制作用而參與了B組CD3+CD8+T細胞的增殖活化與存活,促使B組外周血T細胞亞群紊亂。

總之,本研究顯示當受體獼猴在接受RIC之后,再接受供者貴州香豬的BM和凋亡細胞同時靜脈輸注,誘導異種肝移植受體自發性免疫耐受的機制,可能是通過使受體外周血中Foxp3+CD4+CD25+Treg比例增加,CD3+CD4+T細胞以及CD3+CD8+T細胞上GITR表達降低,從而使得由Foxp3+CD4+CD25+Treg介導的免疫抑制信號增加來實現。

[1] Calne R.A lmost tolerance in the clinic[J].Transplant Proc,1998,30:3846.

[2] Sakaguchi S,Sakaguchi N,Shim izu J,et al.Immunologic tolerance maintained by CD25+CD4+regulatory T cells:their common role in controlling autoimmunity[J].tumorimmunity,and transplantation tolerance.Immunol Rev,2001,182(1):18.

[3] Jiang S,Lechler R I,He X S,et al.Regulatory T cellsand transplan tation tolerance[J].Hum Immunol,2006,67(10):765.

[4] W ood K J,SakaguchiS.Regulatory T cellsin transplantation tolerance[J].Nat Rev Immunol,2003,3(3):199.

[5] Dem irkiran A,Kok A,Kw ekkeboom J,et al.Low circulating regulatory T-cell levels after acute rejection in liver transplantation.Liver Transpl.2006,12(2):277.

[6] Jiang X,Morita M,Sugioka A,et al.The importance of CD25+CD4+regulatory T cells in mouse hepatic allograft tolerance[J].Liver Transpl,2006,12(7):1112.

[7] Amel-KashipazM R,HugginsM L,Lnyon P,et al.Quantitative and qualitative analysis of the balance between type l and type 2 cy tokineproducing CD8-and CD8+T cells in system ic lupus erythematosus[J].JAutoimmun,2001,17(2):155.

[8] Piccirillo C A,Shevach EM.Cutting edge:controlofCD8+T cell activation by CD4+CD25+immunoregulatory cells[J].J Immunol,2001,167(3):1137.

[9] Ronchetti S,Zollo O,BruscoliS,et al.GITR,amember of the TNF receptor superfam ily,is co-stimulatory tomouse T lymphocyte subpopulations[J].Eur J Immunol,2004,34(3):613.

[10] RonchettiS,NocentiniG,Riccardi C,et al.Role of GITR in activation response of T lymphocytes[J].Blood,2002,100(1):350.