大鼠股骨骨折合并腦外傷時早期骨愈合過程中 PDGF的表達

姜小華 張柳 王曉希

臨床發現,骨折合并腦外傷的患者,相對單純骨折患者,其骨痂的數量多、骨折愈合的速度快[1]。1987年 Perkins等[2]報道了這一現象,國內學者也通過動物實驗驗證了這一現象[3],但其作用機制仍未明確。近年來,細胞因子在腦外傷促進骨折愈合方面的研究日益受到重視。我們通過免疫組織化學染色和原位雜交技術,研究大鼠骨折合并腦外傷時血小板衍生生長因子(platelet-derived grow th factor,PDGF)含量的變化與骨折位點的表達,探討 PDGF在腦外傷時骨折愈合過程中可能的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 12周雄性 SD大鼠 32只,體重(356±25)g,購于北京大學醫學部實驗動物科學部。實驗過程中于室溫 20℃自然光照的動物房中分籠飼養,供給大鼠標準飼料,自用飲用水。定期紫外線消毒與排風。喂養 1周適應環境后隨機分為 4組,每組 8只：A組為骨折合并腦外傷 1周組,A 1組為單純骨折 1周組,B組為骨折合并腦外傷 2周組,B1組為單純骨折 2周組。

1.2 主要試劑 PDGF多克隆抗體、HRP SPKit、PDGF-B多點標記的 DIG探針原位雜交試劑盒由天津灝洋生物制品科技有限責任公司提供。

1.3 模型制作 大鼠經 100ml/L水合氯醛(3ml/kg)腹腔內注射麻醉后,制作腦損傷模型[4]：常規去毛、備皮、碘伏消毒,顯露右顱頂骨,中線旁 2mm處開直徑 5mm骨窗,將 20 g砝碼于 30 cm高處通過導向桿墜落,撞擊置于硬膜上的圓錐致中度腦損傷。股骨干骨折模型的制作[5]：右下肢股外側切口,沿股外側肌間隙鈍性分離至股骨干,在股骨干中 1/3用線鋸斷成橫行骨折,然后以直徑 1.5mm克氏針逆行從大粗隆穿出,復位后將克氏針順行穿入股骨遠端髓腔,確認牢固后,0.9%氯化鈉溶液沖洗傷口,分層關閉切口,碘伏再消毒。肌內注射青霉素至術后 5 d(5萬 U/d)預防感染。術畢分籠飼養。

1.4 標本采集與處理 分別將受試大鼠經水合氯醛腹腔內注射麻醉后,于術后第 1、2周心臟取血處死,每組 8只,取大鼠右側完整的股骨標本,0.9%氯化鈉溶液沖洗,攝CR片。在無菌條件下以骨痂為中心截取股骨中 1/3段(包括骨痂、皮質骨、骨髓成分),迅速去除周圍軟組織,將標本置入 4%的多聚甲醛液(DEPC水 +PBS配制)中固定過夜,PBS液沖洗后,置 20%EDTA(DEPC水配制)液中 4℃脫鈣約 5周。取骨痂及周圍組織依次經過脫水、透明、浸蠟、包埋,備用(所用液體試劑均需用DEPC處理或DEPC水配制,接觸標本及容器的洗滌均用 DEPC水。實驗容器及器械在實驗前 1天置高溫烘烤,溫度≥180℃,時間≥8 h)。

1.5 觀察指標

1.5.1 計算機 X線攝像儀(CR)攝片：將大鼠完整的右側股骨干骨折標本經 CR攝片(距離：90 cm,電壓：40 kV,電流：3.2mA),觀察大鼠股骨骨折骨痂的連續性及骨折愈合情況。

1.5.2 HE染色：制備 5μm石蠟切片,經脫蠟、水化、蘇木素染核、鹽酸酒精分化、伊紅染漿、脫水透明,最后中性樹膠封片,光鏡下觀察骨痂生長情況及其組織形態。

1.5.3 免疫組織化學染色：制備 5μm石蠟切片,常規脫蠟至水,3%H2O2溶液封閉內源性過氧化物酶,5%山羊血清封閉非特異性抗原,加一抗(1∶100)于 4℃孵育過夜,滴加生物素化二抗,高敏過氧化物酶復合物,DAB顯色,蘇木素復染。每次染色均用PBS液代替一抗作為陰性對照。采用 HPIAS-1000高清晰度彩色圖像分析系統(同濟醫科大學千屏影像工程公司),在400倍視野下,隨機選取 6個視野,統計每個視野總的細胞數和陽性細胞數,計算陽性細胞百分數,以 6個視野的平均值作為此標本的 PDGF陽性細胞百分數。

1.5.4 原位雜交：制備 5μm石蠟切片 DEPC水撈片(雜交專用玻片),置 56℃烤箱過夜后脫蠟至水,室溫置打孔液后10min,3%雙氧水 20m in封閉內源性過氧化物酶,滴加復合消化工作液 30min,預雜交工作液 37℃濕盒孵育 1h,滴加雜交工作液 37℃濕盒孵育 4 h,滴加小鼠抗地高辛生物素標記的抗體工作液 37℃濕盒孵育 45min,高敏過氧化物酶復合物 37℃濕盒孵育 45m in,DAB顯色,蘇木素復染。每次染色均用寡核苷酸陰性探針雜交液代替雜交工作液作為陰性對照。采用HPIAS-1000高清晰度彩色圖像分析系統(同濟醫科大學千屏影像工程公司),在 400倍視野下,隨機選取 6個視野,統計每個視野總的細胞數和陽性細胞數,計算陽性細胞百分數,以 6個視野的平均值作為此標本的 PDGFmRNA陽性細胞百分數。(操作時戴無菌手套,所用液體試劑均需用 DEPC處理或 DEPC水配制,接觸標本及容器的洗滌均用 DEPC水。實驗容器及器械在實驗前 1天置高溫烘烤,溫度≥180℃,時間≥8 h。

1.6 統計學分析 應用 SPSS 11.0統計軟件,計量資料以±s表示,采用單因素方差分析和t檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 X線片觀察 在同一時間點骨折合并腦外傷組較單純骨折組對位對線好,骨折端骨痂形成早,骨痂大,骨折愈合加快。見圖 1。

圖 1 X線片觀察

2.2 HE染色 A組可見較多早期軟骨細胞、成纖維細胞;A 1組骨折間隙可見成纖維細胞,僅夾雜有少量的早期軟骨細胞;B組骨折端有新生骨小梁長入;B1組未見有骨小梁形成。

2.3 免疫組織化學染色 以細胞中含有明顯的棕黃色顆粒者為陽性表達。術后 1周骨膜內增殖細胞、骨折端周圍肉芽組織中的纖維母細胞、間充質細胞、血管內皮細胞、早期軟骨細胞、成骨細胞胞漿均出現廣泛的強陽性反應,合并腦外傷組陽性細胞數量多于單純骨折組,并且顯色強。圖像分析顯示,A、B組平均陽性細胞百分數均高于同一時間點 A 1、B1組,差異有統計學意義(P＜0.05)。見表 1。

2.4 原位雜交 以細胞中含有明顯的棕黃色顆粒者為陽性表達。成纖維細胞、間充質細胞、血管內皮細胞、早期軟骨細胞、成骨細胞、破骨細胞胞漿在不同時間點分別出現廣泛的PDGFmRNA表達,骨痂 PDGFmRNA含量在 2周表達增強,PDGFmRNA陽性細胞百分數比較且 A、B組骨痂 PDGFmRNA陽性細胞百分數均顯著高于同一時間點 A 1、B1組,差異有統計學意義(P＜0.05)。見表 1。

表 1 4組 PDGF平均陽性細胞百分數和 PDGFmRNA表達水平比較n=8,%,±s

表 1 4組 PDGF平均陽性細胞百分數和 PDGFmRNA表達水平比較n=8,%,±s

注：與A 1組比較,＊P＜0.05;與B1組比較,#P＜0.05

組別 PDGF平均陽性細胞 PDGFmRNA平均陽性細胞A組 0.872±0.021＊ 0.385±0.046＊A1組 0.803±0.042 0.204±0.042 B組 0.781±0.036# 0.602±0.050#B1組 0.712±0.027 0.438±0.026

3 討論

大量臨床病例發現：骨折患者若同時伴有腦外傷,其骨折愈合過程明顯加快,甚至在未見骨折的某些關節周圍出現異位骨化現象[1-3]。本次實驗CR片和HE染色發現發現合并腦損傷的骨折愈合明顯好于單純骨折組,表明腦損傷可以促進骨折愈合。關于腦外傷后加速骨折愈合的調節因素,國內外學者已開始在分子生物學水平進行研究,并逐漸認識到細胞因子的特殊作用[6-10]。我們的實驗從蛋白水平和基因水平研究骨折愈合中骨痂 PDGF的變化,發現骨折合并腦外傷組 PDGF和PDGFmRNA表達均顯著高于同一時間點單純骨折組,PDGFmRNA在 1周時有陽性表達后逐漸增強,2周出現高峰表達,PDGF在骨折愈合過程中分別在不同細胞內呈強陽性表達。故我們的實驗結果提示腦損傷促進了骨折局部 PDGF及 PDGFmRNA的表達,峰值上調。

骨折愈合是一個復雜的過程,受到各種因素的嚴格控制,其中起主要作用的是局部的骨生長因子或細胞因子。各種生長因子協同作用促進骨折的愈合,其中PDGF在成骨及骨重建過程中起著重要作用[11]。作為重要的有絲分裂原,PDGF可在創傷骨組織中高效表達,對成骨細胞的增殖、分化起重要作用：PDGF能夠促進成骨細胞早期的 DNA合成,使成骨細胞從靜止狀態的 G0/G 1期進入到有復制潛能的 S期,使分泌期細胞增多;同時還能增強單核細胞、成纖維細胞的游走性,使局部成纖維細胞增殖、分化,從而促進骨形成[12]。在我們的研究中,免疫組織化學染色和原位雜交結果顯示骨痂組織中有 PDGF及PDGFmRNA的表達,前者在 1周時就有高峰表達,2周仍持續強陽性表達,后者早期表達主要在新生毛細血管內皮細胞,2周時有高峰表達,提示PDGF早期可能以旁分泌形式啟動后又刺激多種細胞自分泌并參與了骨折早期修復的過程。

我們的實驗結果表明,腦外傷時骨折部位PDGF的表達增加,骨折愈合加速,PDGF可能在腦外傷加速骨折愈合中起了重要作用。此研究為臨床促進骨折愈合,及骨折不愈合和延遲愈合、骨質疏松骨折的分子治療提供重要參考依據。

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5 Li C,Mori S,Li J,et al.Long-term effect of incadronate disodium(YM-175)on fracture healing of femoral shaft in growing rats.JBone Miner Res,2001,16：429-436.

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10 王守君,張柳.大鼠股骨骨折合并腦外傷時骨愈合過程中 TGF-β1的作用.第四軍醫大學學報,2006,27：1407-1410.

11 Andrew JG,Hoyland JA,Freemont AJ,et al.Platelet-derived growth factor expression in normally healing human fractures.Bone,1995,16：455-460.

12 蘇佳燦,許碩貴.血小板衍生生長因子在骨重建中的作用及機制.國外醫學骨科學分冊,2001,22：85-87.