非酒精性脂肪性肝病患者肝組織脂聯(lián)素表達及其意義

趙彩彥 孔令波 李亞 王亞東 周俊英 甄真

非酒精性脂肪性肝病患者肝組織脂聯(lián)素表達及其意義

趙彩彥 孔令波 李亞 王亞東 周俊英 甄真

目的 探討肝組織脂聯(lián)素表達在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)發(fā)病機制中的作用及地位,為 NAFLD的預(yù)防及治療提供新的思路。方法 47例 NAFLD患者及 20例正常對照均測量身高、體重,計算體重指數(shù)(BMI);分別應(yīng)用ELISA方法測定血清脂聯(lián)素(adiponectin)濃度、血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)濃度;采用穩(wěn)態(tài)模式評估法,計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR);對肝組織進行 HE、Masson染色及脂聯(lián)素免疫組化染色,對脂聯(lián)素表達量進行半定量分析。結(jié)果 非酒精性脂肪性肝炎(NASH)組肝組織脂聯(lián)素表達較對照組及單純性脂肪肝組顯著減少(P＜0.05),與血清脂聯(lián)素濃度呈顯著正相關(guān)(P＜0.01),與血清 TNF-α濃度、ALT、HOMA-IR及肝組織炎癥、纖維化程度呈負相關(guān)(P＜0.01),而與脂變程度不相關(guān)(P＞0.05)。多元線性逐步回歸分析顯示,肝組織脂聯(lián)素表達是肝組織炎癥及纖維化發(fā)生的保護因素。結(jié)論

肝組織脂聯(lián)素表達在NAFLD患者肝組織炎癥及纖維化發(fā)生發(fā)展中起保護性作用。

脂聯(lián)素;脂肪肝,非酒精性;肝組織

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)。脂聯(lián)素是一種近年新發(fā)現(xiàn)的脂肪細胞因子,有胰島素增敏、抗炎等作用[1]。本實驗應(yīng)用免疫組化染色方法,研究脂聯(lián)素在 NAFLD患者肝組織的表達情況及其與胰島素抵抗(insulin resistance,IR)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平及肝組織病理改變的關(guān)系,揭示肝組織表達的脂聯(lián)素在NAFLD發(fā)病機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2006年 7月至 2007年 6月于我院就診的NAFLD患者 47例,男 26例,女 21例;平均年齡(44±14)歲,符合中華醫(yī)學(xué)會肝臟病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組 2006年2月修訂的 NAFLD臨床診斷標準[2],其中 16例行肝組織活檢經(jīng)病理證實。根據(jù)有無 ALT升高或肝組織病理結(jié)果,分為非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)組及單純性脂肪肝組。對照組 20例,男 10例,女 10例;平均年齡(41±13)歲;其中健康獻血員 15例,行肝血管瘤切除術(shù)者 5例。3組年齡、性別比等差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 材料 脂聯(lián)素單克隆抗體,購自英國abcam公司;脂聯(lián)素及 TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購于美國 RB公司。

1.3 體重指數(shù)(bodymass index,BMI)及生化指標測定 所有研究對象均測量身高及體重,計算 BMI=體重(kg)/身高(m)2;ALT、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)用日本Olympus AU 2700全自動生化分析儀檢測;空腹胰島素(fasting insulin,FINS)水平用放射免疫法測定。采用穩(wěn)態(tài)模式評估法(homeostasismodel assessment,HOMA)計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR),HOMA-IR=FINS×FBG/22.5,取自然對數(shù)后成為正態(tài)分布。

1.4 血清脂聯(lián)素及 TNF-α濃度 ELISA方法測定。

1.5 病理檢查 將肝活檢組織及肝血管瘤切除術(shù)中所取正常肝組織進行石蠟包埋,制成 5μm厚連續(xù)切片。HE染色觀察普通病理,每張切片隨機選擇 10個視野,20倍物鏡下計算平均脂變肝細胞百分比;炎癥活動度根據(jù)美國NASH臨床研究協(xié)會2005年制定的NAFLD組織學(xué)評分系統(tǒng)[3]進行評分,積分標準分為小葉內(nèi)炎癥(L,0～3)、肝細胞氣球樣變性(B,0～2)、匯管區(qū)炎癥(P,0～1),由富有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生在不知分組的情況下作出評分,將各種病理變化評分相加得到總積分,記分公式為 L+B+P。Masson染色觀察纖維化程度。

1.6 免疫組化染色 采用 Power Vision TM二步法：將石蠟包埋的肝組織制成 5μm厚連續(xù)切片;常規(guī)脫蠟至水;高壓修復(fù)抗原;3%H2O2溶液室溫孵育 10m in;胃蛋白酶消化,37℃孵育30min;滴加鼠抗人脂聯(lián)素單克隆抗體,4℃過夜;滴加山羊抗小鼠 IgG抗體-HRP多聚體,37℃孵育 30min;滴加 DAB顯色劑,顯色 2min,自來水終止顯色;蘇木精復(fù)染,中性樹膠封片。PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。棕黃色著色為陽性表達。

1.7 病理圖像分析 肝組織脂聯(lián)素表達量及膠原纖維含量采用多功能病理圖像分析儀(北京航空航天大學(xué)圖像中心研制)進行分析。20倍物鏡下計算平均面密度(陽性面積與統(tǒng)計場面積百分比),以平均面密度作為半定量分析指標。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件,計量資料以±s表示,比較用單因素方差分析或用Kruskal-Wallis H檢驗,LSD-t法或 Nemenyi法進行組間比較,相關(guān)分析用直線相關(guān)及多元線性逐步回歸,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMI、生化指標及血清脂聯(lián)素濃度 單純性脂肪肝組及NASH組BMI及 HOMA-IR顯著高于對照組(P＜0.01),單純性脂肪肝組與 NASH組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);NASH組ALT、TNF-α顯著高于單純性脂肪肝組及對照組 (P＜0.01),單純性脂肪肝組與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);血清脂聯(lián)素濃度在 3組各不相同,從高到低依次為對照組、單純性脂肪肝組、NASH組(P＜0.01)。見表 1。

2.2 肝組織病理學(xué)變化 16例行肝組織活檢的患者中,單純性脂肪肝與 NASH各占 8例。單純性脂肪肝組患者肝細胞存在不同程度脂肪變性;NASH組患者肝組織存在肝細胞脂肪變性,小葉內(nèi)有炎性細胞浸潤、點狀或灶性壞死,有竇周纖維化,匯管區(qū)可見炎性細胞浸潤,向小葉內(nèi)延伸,偶見P-V橋接壞死。

2.3 肝組織脂聯(lián)素表達 肝組織免疫組化染色可見脂聯(lián)素主要表達于肝竇內(nèi)皮細胞及匯管區(qū)血管內(nèi)皮細胞,在炎性壞死區(qū)域也有表達(圖1),單純性脂肪肝組及對照組肝組織脂聯(lián)素表達量顯著高于 NASH組(P＜0.01),單純性脂肪肝組與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表 2。

圖1 肝組織脂聯(lián)素表達(免疫組化 ×200)

2.4 相關(guān)性分析

2.4.1 血清脂聯(lián)素濃度的相關(guān)分析：所有 NAFLD患者血清脂聯(lián)素濃度與 BMI、HOMA-IR、血清 ALT、TNF-α濃度呈顯著負相關(guān)(r分別為 -0.623、 -0.614、-0.809、 -0.664,P＜0.01)。

2.4.2 肝組織脂聯(lián)素表達的相關(guān)分析：在行病理檢查的NAFLD患者中,肝組織脂聯(lián)素表達量與血清脂聯(lián)素濃度呈顯著正相關(guān),(r=0.821,P＜0.01);與 BMI、HOMA-IR、血清 ALT、TNF-α濃度、肝組織炎癥活動度及膠原纖維含量呈負相關(guān),(r分別為 -0.550、 -0.529、-0.805、 -0.739、 -0.783、 -0.798,P＜0.01);與肝脂變程度不相關(guān)(P＞0.05)。

2.5 多元線性逐步回歸 對行病理檢查的NAFLD患者,采用多元逐步回歸法,以肝組織炎癥(Y)為應(yīng)變量,以肝組織脂聯(lián)素表達量(X1)、血清脂聯(lián)素濃度(X2)、BMI(X3)、HOMA-IR(X4)及血清 TNF-α濃度(X5)為自變量建立回歸方程,在0.05水準,肝組織脂聯(lián)素表達量及血清TNF-α濃度進入方程,Y=-3.401-57.473×1+2.83×5,R2=0.756。說明 NAFLD患者肝組織局部表達的脂聯(lián)素在肝組織炎癥的發(fā)生中起保護性作用。以肝組織膠原纖維含量(Y)為應(yīng)變量,以肝組織脂聯(lián)素表達量(X1)、血清脂聯(lián)素濃度 (X2)、BMI(X3)、HOMA-IR(X4)及血清TNF-α濃度(X5)為自變量建立回歸方程,在 0.05水準,肝組織脂聯(lián)素表達量及血清 TNF-α濃度進入方程,Y=-0.031-0.507×1+0.035×5,R2=0.836。說明 NAFLD患者肝組織局部表達的脂聯(lián)素在肝組織纖維化的發(fā)生中起保護性作用。

表1 3組 BMI、生化指標及血清脂聯(lián)素濃度比較±s

表1 3組 BMI、生化指標及血清脂聯(lián)素濃度比較±s

注：與對照組比較,＊P＜0.01;與單純性脂肪肝組比較,#P＜0.01

組別 BM I(kg/m 2) HOMA-IR(對數(shù)值) ALT(U/L) TNF-α(pg/m l) 脂聯(lián)素濃度(μg/m l)對照組(n=20) 20.3±2.1 1.18±0.20 19±3 2.02±0.16 3.81±0.4單純性脂肪肝組(n=28) 27.9±2.9＊ 2.18±0.28＊ 21±8 2.16±0.16 2.8±0.6＊NASH組(n=19) 28.3±1.9＊ 2.19±0.33＊ 75±14 2.66±0.38＊# 1.3±0.3＊#F/H值 72.971 96.367 40.542 32.316 159.246 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表2 3組肝組織脂聯(lián)素表達量及肝組織病理改變比較±s

表2 3組肝組織脂聯(lián)素表達量及肝組織病理改變比較±s

注：與對照組比較,＊P＜0.01;與單純性脂肪肝組比較,#P＜0.01

組別 脂聯(lián)素表達量(%) 肝脂變(%) 炎癥活動度(分) 膠原纖維量(%)對照組(n=5) 4.2±0.8 1.2±1.0 0 2.00±0.21單純性脂肪肝組(n=8) 3.3±0.3 42.5±19.5＊ 0 2.23±0.25 NASH組(n=8) 1.8±0.6＊# 42.9±18.8＊ 3.63±1.06 5.87±1.19＊#F/H值 32.525 10.945 17.667 15.731 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

3 討論

脂聯(lián)素在 NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起著保護性作用。盡管有研究報道,脂聯(lián)素通過減少脂質(zhì)合成,增加脂肪酸氧化,減少肝臟脂質(zhì)含量[3]。但是,在本研究中,肝組織脂聯(lián)素表達量在單純性脂肪肝組與對照組之間無差異,在NASH組卻顯著降低,并且與肝組織炎癥及纖維化程度密切相關(guān),與肝脂變程度不相關(guān),提示,肝組織表達的脂聯(lián)素在肝臟主要發(fā)揮其抗炎、抗纖維化作用。

本研究發(fā)現(xiàn),血清脂聯(lián)素濃度及肝組織脂聯(lián)素表達量均與炎癥因子 TNF-α水平呈負相關(guān),肝組織脂聯(lián)素表達量與肝組織炎癥程度呈負相關(guān),多元逐步回歸分析提示 NAFLD患者肝組織局部表達的脂聯(lián)素在肝組織炎癥的發(fā)生中起保護性作用。脂聯(lián)素刺激抗炎因子的釋放、抑制炎性因子的產(chǎn)生是其抗炎作用的主要體現(xiàn)。脂聯(lián)素可以抑制脂肪組織C-反應(yīng)蛋白及TNF-α產(chǎn)生;通過環(huán)磷腺苷/蛋白激酶 A依賴的信號途徑抑制內(nèi)皮細胞 IL-8、血管細胞粘附分子-1及反應(yīng)性氧簇產(chǎn)生;通過刺激環(huán)氧合酶-2/前列腺素 E2途徑抑制心肌細胞 TNF-α產(chǎn)生;通過抑制 Toll樣受體介導(dǎo)的 NF-κB活化減少巨噬細胞 TNF-α及 IL-6產(chǎn)生,通過增加IL-10產(chǎn)生增加金屬蛋白酶組織抑制劑-1產(chǎn)生[5]。在肝臟,脂聯(lián)素可能通過這些途徑發(fā)揮其抗炎作用。脂聯(lián)素表達減少使其在肝臟的抗炎作用減弱,導(dǎo)致炎癥的發(fā)生發(fā)展。另外,脂聯(lián)素與 TNF-α可以抑制對方的表達,并抑制對方在靶器官的作用[6],在肝組織發(fā)生炎癥后,表達增加的 TNF-α可能抑制了脂聯(lián)素在肝臟的表達及其抗炎作用,使脂聯(lián)素抑制TNF-α的作用減弱,因此形成惡性循環(huán),使炎癥進一步發(fā)展。

在本研究中,肝組織脂聯(lián)素表達量與肝組織膠原纖維含量呈負相關(guān),多元逐步回歸分析提示 NAFLD患者肝組織局部表達的脂聯(lián)素在肝組織纖維化的發(fā)生中起保護性作用。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor,TGF-β1)及肝星狀 細胞(hepatic stellate cells,HSC)在肝纖維化發(fā)生中起著關(guān)鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn),與相同處理條件下野生型小鼠相比,脂聯(lián)素基因敲除小鼠在經(jīng)四氯化碳刺激 12周后,血漿 TGF-β1、結(jié)締組織生長因子水平明顯升高,肝臟發(fā)生廣泛的纖維化,證實脂聯(lián)素可以通過抑制 TGF-β1、結(jié)締組織生長因子表達阻止肝纖維化的發(fā)生[7]。另外,在小鼠HSC培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn),靜止狀態(tài)HSC可以表達脂聯(lián)素 mRNA及脂聯(lián)素蛋白,脂聯(lián)素通過減少 α-平滑肌肌動蛋白(α-smoothmuscle actin,α-SMA)和增殖細胞核抗原表達抑制活化HSC的增殖與遷移,并促進其凋亡,抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[8]。另外,TNF-α除了參與炎性反應(yīng)外,還可以通過激活HSC等途徑參與肝纖維化的發(fā)生,所以,脂聯(lián)素的抗纖維化作用還與其對TNF-α抑制作用相關(guān)。

本研究顯示,脂聯(lián)素主要表達于肝竇內(nèi)皮細胞、匯管區(qū)血管內(nèi)皮細胞,炎癥區(qū)域也有表達,肝細胞沒有表達。現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了Ⅰ、Ⅱ兩型 G蛋白偶聯(lián)脂聯(lián)素受體,其中Ⅱ型主要表達于肝細胞膜[9],脂聯(lián)素在上述細胞及區(qū)域表達后,通過旁分泌途徑作用于肝細胞膜上受體。脂聯(lián)素與其受體結(jié)合后通過活化一磷酸腺苷活化的蛋白激酶以及激活 p38絲裂原激活的蛋白激酶兩個途徑,引起下游一系列分子活性的改變,發(fā)揮其生物學(xué)作用[10]。在本研究中,NASH組患者肝組織脂聯(lián)素表達較單純性脂肪肝組及對照組減少,單純性脂肪肝組與對照組之間無差異,而血清脂聯(lián)素濃度在 NASH組低于單純性脂肪肝組及對照組,單純性脂肪肝組低于對照組。在NAFLD發(fā)生時,脂聯(lián)素在其他組織的表達量也發(fā)生改變,并影響血清脂聯(lián)素濃度。有研究證實,在 NAFLD患者,脂肪組織脂聯(lián)素 mRNA表達量減少[11]。

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Exp ression and significance of adiponectin in liver of patientswith nonalcoholic fatty liver disease

ZHAO Caiyan＊,KONG Lingbo＊,LIYa,eta l.＊Department of In fectious Disease,The Third Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050051,China

Objective To investigate the changes of expression of adiponectin in the liver and their significance in patients with nonalcoholic fatty liverdisease(NAFLD).M ethods 47 patientswith NAFLD and 20 healthy subjects were chosen in our study.Serum adiponectin and tumor necrosis factor-α(TNF-α)were quantified by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).The levels of body mass index(BMI),alanine aminotransferase(ALT),fasting blood glucose and fasting insulin were also assayed.Insulin resistance(IR)was estimated by using the homeostasis model assessment(HOMA).The histological manifestation of liver was analyzed by HE and Masson staining.The expression of adiponectin in the liver was detected by immuno histochemical staining,and the relative quantity ofadiponectin was assessed by sem iquantitative analysis.Resu lts

The relative quantity ofadiponectin in liver of NASH patients was remarkably lower than that in simple steatotic liver and normal liver.The expression ofadiponectin in the liver was positively correlated with the levels of serum adiponectin,and negatively correlated with the levels of serum TNF-α,ALT,HOMA-IR and the degreeof hepatic inflammation and fibrosis.The mu ltivariant linear gradual regressive analysis showed that the exp ression of adiponectin in the liver was a p rotective factor of hepatic inflammation and fibrosis.Conclusion The exp ression of adiponectin in the liver acts as a protective factor in the developmentof inflammation and fibrosis in NAFLD.

adiponectin;fatty liver;nonalcoholic

R 575

A

1002-7386(2010)05-0522-04

050051 石家莊市,河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院感染科(趙彩彥、孔令波、王亞東、周俊英、甄真),中心實驗室(李亞)

2009-11-13)