慢性HBV感染患者外周血CD4+CD25+調節性T細胞表達及其臨床意義*

呂 峰 郜玉峰 崔明芳 張振華 尹華發

在HBV感染中，T淋巴細胞作為主要的效應細胞，與病毒的清除直接相關。但研究發現，慢性HBV感染者常表現為免疫細胞功能低下，CD4+CD25+調節性T細胞能通過細胞直接接觸而抑制CD4+T細胞和CD8+T細胞等細胞的活性，在細胞免疫調節中具有重要的作用。CD4+CD25+調節性T細胞在外周循環中的表達頻率和功能改變直接影響到細胞免疫反應的強弱，從而決定抗病毒的療效。因此，本文通過研究CD4+CD25+調節性T細胞在慢性乙型肝炎（CHB）、無癥狀HBsAg攜帶者（ASC）和肝炎肝硬化（LC）患者外周血單個核細胞（PBMC）的表達水平及其與不同臨床轉歸的相關性，以探討其在慢性乙型肝炎發病機制中的作用。

材料與方法

一、研究對象 我科2008年9月至2009年3月門診和住院的CHB患者26例，ASC 15例，LC患者11例。男性42例，女性10例，平均年齡35±11歲。診斷均符合2000年中華醫學會修訂的《病毒性肝炎防治方案》的標準[1]。所有病例均未合并其他嗜肝病毒感染或其它慢性疾病，排除了重疊HIV感染，入組前3個月內未應用任何抗病毒治療，無胸腺肽、免疫球蛋白、甘草酸類、聯苯雙脂等藥物治療史。另選16例正常對照者，男9例，女7例，平均年齡34±12歲。

二、主要儀器及試劑 FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司；Centrifuge 5810R和5415R型離心機購自德國Eppendorf公司；MODULAR—DPP型全自動生化分析儀購自上海羅氏公司；7300型RT-PCR機購自美國ABI公司。IgG-異硫氰酸熒光素（FITC）、IgG-藻紅蛋白 （PE）、IgG-葉綠素蛋白 （Percp）、抗CD25-FITC、抗CD4-PE、抗CD3-Percp試劑購自美國Ebioscience公司；淋巴細胞分離液購自北京Solarbio公司；RPMI-1640培養液為自行配制，干粉購自美國Flow公司。

三、外周血T淋巴細胞亞群和CD4+CD25+調節性T細胞的檢測 新鮮采集的EDTA抗凝全血，應用Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，用含有10%牛胎血清的RPMI-1640培養濃集，37℃，5%CO2溫箱條件下培養24小時后收獲細胞。根據細胞計數取大約105細胞，加入人新鮮血清或IgG，放置30分鐘以封閉細胞表面Fc段受體，然后加入抗CD25-FITC、抗CD4-PE、抗CD3-Percp試劑表面染色，同時另取一管加入IgG-FITC、IgG-PE、IgG-Percp作為同型對照。4℃，避光放置30分鐘后用PAS洗三次，加固定液，再放置4℃避光30分鐘，上機檢測。使用CELLQUEST軟件進行分析，以前向角散射光（FSC）為橫坐標，側向角散射光（SSC）為縱坐標，建立二維散點圖，在散點圖上調整閾值參數，排除碎片和噪聲的干擾，圈定淋巴細胞設門以獲取細胞。以同型對照分別設定不同熒光素的陰性界限，檢測并記錄熒光抗體染色陽性CD3+和CD4+分子的表達情況。再以CD3-SS設門，將CD4+CD25+T細胞亞群作為CD4+CD25+調節性T細胞的表型，分析門內CD4+CD25+調節性T細胞占CD4+T細胞的百分率，采用Winmdi Version2.8功能軟件進行數據分析。

四、臨床指標的檢測 采用ELISA法（上海科華生物科技有限公司）檢測HBV血清學標志物；采用羅氏全自動生化分析儀檢測肝功能；采用熒光定量PCR法（廣州中山大學達安基因有限公司）檢測HBV DNA。檢測結果以＞103copies/ml判斷為陽性。

五、統計學處理 各組間數據取均數±標準差表示，所有資料均使用SPSS 11.0統計學軟件進行t檢驗和直線相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、各組患者CD4+CD25+調節性T細胞的比例

CHB組、ASC組及正常對照組外周血CD4+CD25+調節性T細胞占CD4+T細胞的比例分別為4.40±2.76%、4.43±2.10%和2.70±0.97%，CHB組和ASC組的CD4+CD25+調節性T細胞比例較正常對照組升高，差異有統計學意義（P＜0.01），見表 1。

表1 HBV感染者外周血T淋巴細胞亞群及CD4+CD25+調節性T細胞的百分率（%）

二、慢性HBV感染者HBeAg與CD4+CD25+調節性T細胞的關系 HBeAg陽性組CD4+CD25+調節性T細胞占CD4+比例為4.17±2.30%，HBeAg陰性組為4.30±2.43%，兩者差異無統計學意義（t=-0.181，P＞0.05）。但兩組與正常對照組比較均有顯著性差異（P＜0.01），見表 2。

表2 HBeAg與CD4+CD25+調節性T細胞百分率（%）的關系

三、慢性HBV感染者HBV DNA水平與CD4+CD25+調節性T細胞的關系 根據HBV DNA水平將患者分為高拷貝組（＞105copies/ml）和低拷貝組（＜105copies/ml）。結果HBV DNA高拷貝組患者外周血CD4+CD25+調節性T細胞占CD4+比例為4.23±2.12%，而HBV DNA低拷貝組為4.28±2.73%，差異無統計學意義（P＞0.05）。

討 論

CD4+CD25+調節性T細胞能維持免疫耐受和抑制抗原特異性或非特異性T細胞應答。國內外研究認為，在HBV感染者中針對HBV特異性的T細胞應答的減弱可能與CD4+CD25+調節性T細胞的作用有關，并且與HBV感染后病毒的清除、病情進展及臨床轉歸有密切的關系[1]。Franzese等[3，4]在慢性HBV感染者中發現CD4+CD25+調節性T細胞對HBV特異性CTL細胞和Th細胞有抑制作用，并參與了HBV感染的慢性化過程。CD4+CD25+調節性T細胞水平增高的原因可能與CD4+CD25+調節性T細胞表面的一些負性共刺激因子過度表達有關，如 CTLA-4、PD-1、Galectin-9 等[5～8]可能影響它的表達水平和功能改變。我們的研究結果發現：在CHB和ASC組CD4+CD25+調節性T細胞的表達率均顯著高于正常對照組，但CD4+CD25+調節性T細胞的表達率在CHB、ASC和LC三組中無統計學差異（P＞0.05），可能與病例數較少有關。對于CHB患者，CD4+CD25+調節性T細胞數量是否增加仍存在爭議。Franzese等[3]發現免疫耐受患者、慢性活動性乙型肝炎患者及無癥狀HBV攜帶者CD4+CD25+調節性T細胞數量與健康對照之間無明顯統計學差異。這些仍需大樣本觀察的驗證。

我們的觀察結果顯示，慢性乙型肝炎患者外周循環中CD4+CD25+調節性T細胞的頻率與血清轉氨酶水平無相關性（資料未列出）。這與Xu等[9]通過對l6例AHB、76例CHB和29例慢性重型肝炎患者外周循環和肝臟中浸潤的CD4+CD25+調節性T細胞的頻率、表型特征分子和對抗病毒應答的影響等進行研究的結果一致。本文發現CD4+CD25+調節性T細胞的表達與外周血HBV DNA水平及HBeAg陽性與否也無明顯的相關性，與沈俊輝等[10]研究結果相同，但與Stoop和Peng等[4，5]研究結果有所不同。他們報道CD4+CD25+調節性T細胞頻率與血清病毒載量呈正相關，HBeAg陽性的HBV感染者CD4+CD25+調節性T細胞水平明顯高于HBeAg陰性者，可能的原因是HBeAg的存在更容易激發機體的免疫反應，進而促進CD4+CD25+調節性T細胞的過度表達，以達到免疫抑制的目的，免疫抑制效應又促進了病毒的復制，在CHB的免疫耐受中起一定的作用。

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