Tregs調節小鼠肝癌局部引流淋巴結內免疫效應細胞的功能*

汪禮坤， 匡 銘， 彭寶崗， 何 強， 李紹強， 華赟鵬， 陳 斌， 王 曄

(中山大學附屬第一醫院肝膽外科，廣東廣州510080)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)發病率居世界最常見癌癥第5位，居最常見癌癥死亡原因第3位。目前早期肝細胞癌傳統的治療方法包括外科手術切除、肝臟移植和局部消融(射頻消融或無水酒精注射)，其5年生存率達到50%－70%，但較高的復發率影響手術切除和局部消融的療效，輔助治療難以預防復發，且肝臟移植仍存在供體短缺問題［1］。

肝細胞癌免疫治療方法包括過繼免疫活性細胞、應用呈遞腫瘤抗原的樹突狀細胞或腫瘤疫苗等措施，臨床應用表明可產生不同程度的免疫效應，影響肝癌病人的復發率和生存率［2］。然而腫瘤免疫抑制微環境與腫瘤抗原弱免疫原性不利于免疫效應細胞發揮作用和激發產生抗腫瘤免疫反應。臨床研究顯示小肝癌局部腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)高濃度的患者肝切除術后的復發率顯著低于腫瘤局部無淋巴細胞浸潤者［3］，而調節性T細胞(regulatory T cells，Tregs)使TILs功能低下［4］。CD4+CD25+Foxp3+Treg不僅調節自體免疫耐受［5］，而且通過其免疫抑制作用影響抗腫瘤免疫反應的產生，促進腫瘤進展，維持腫瘤免疫耐受微環境，影響臨床免疫治療療效［6，7］。腫瘤病人存在免疫抑制現象，腫瘤引起機體免疫耐受和抑制抗腫瘤免疫效應的產生及機制有待闡明。許多證據表明腫瘤引流淋巴結(tumor－draining lymph nodes，TDLNs)體積雖小，卻是一個免疫特惠/耐受位點，TDLNs內抗原提呈細胞(APCs)的表型和功能發生活性改變，呈遞腫瘤抗原偏向于耐受產生，在產生和維持腫瘤抗原獲得性外周耐受進而導致全身耐受中發揮重要作用。已知TDLNs內Treg數量增加且抑制活性增強［8］，Tregs可能是影響TDLNs免疫狀態的關鍵因素，然而其確切機制尚未闡明。本研究旨在通過建立小鼠肝癌TDLNs模型，探討TDLNs內Tregs影響機體全身免疫耐受狀態和抑制特異性抗腫瘤免疫反應的作用及機制。

材料和方法

1 主要試劑

RPMI－1640培養基和Trizol試劑購自Invitrogen，細菌脂多糖(LPS，L2880)購自Sigma，免疫組化Ⅰ抗 rabbit anti－mouse Foxp3、rat anti－mouse CD4、rat anti－mouse CD8均購自Biolegend，兔二步法和大鼠二步法檢測試劑盒(Ⅱ抗)購自北京中杉金橋。流式細胞術抗體APC－conjugated anti－mouse Foxp3、FITC－conjugated anti－mouse CD4和PE－conjugated anti－mouse CD25均購自eBioscience。RT－PCR kit和SYBR green realtime PCR master mix購自Toyobo。Anti－CD3抗體(clone:145－2C11)購自eBioscience。小鼠IFN－γ酶聯免疫斑點法(enzyme－linked immunosorbent spot technique，ELISPOT)試劑盒購自R＆D Systems。

2 Hepa1－6細胞培養

Hepa1－6肝癌細胞株來源于C57BL/6J小鼠的化學誘導肝腫瘤。應用含10%FBS、100 mg/L青霉素G和1×105U/L鏈霉素的RPMI－1640培養基在37℃、5%CO2環境培養箱內培養Hepa1－6細胞，傳代后收集細胞。

3 建立小鼠肝癌TDLNs模型

6－8周齡大小雌性C57BL/6J小鼠購自中山大學和南方醫科大學實驗動物中心，飼養于中山大學實驗動物中心。懸浮于20 μL PBS的Hepa1－6細胞(6×105cells)注射于每只小鼠右后肢足掌皮下，觀察腫瘤生長，每隔3 d測量腫瘤長徑。第12 d處死小鼠，獲取足掌腫瘤側的腘淋巴結(TDLNs)并稱重，同時獲取同側腹股溝淋巴結(第二站引流淋巴結)以及脾臟，小鼠腫瘤足重量減去對側正常足重量測得腫瘤重量，最后剖檢小鼠，觀察肺、肝外觀及有無轉移結節。作為對照，細菌脂多糖(LPS)溶于蒸餾水中，濃度1 g/L，每只小鼠右后肢足掌皮下每天注射20 μg，連續2 d，2 d后處死小鼠并收集上述淋巴結標本和脾臟。

4 免疫組織化學染色

Foxp3染色所用標本為4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，每例蠟塊連續切片數張，厚4 μm，1張備染，其余行HE染色，鏡下觀察有無腫瘤細胞淋巴結轉移。組織切片置檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中高壓抗原修復4 min，0.3%Triton破膜40 min，室溫放置于3%H2O2中15 min以阻斷內源性過氧化物酶，滴加Ⅰ抗rabbit anti－mouse Foxp3(稀釋度1∶150)，4℃孵育過夜，加Ⅱ抗室溫孵育2.5 h，DAB顯色。CD8和CD4染色采用OCT包埋的新鮮標本的冰凍切片(厚6 μm)，4℃丙酮固定切片10 min，－20℃保存備用。CD8和CD4Ⅰ抗稀釋度1∶200，滴加Ⅰ抗后室溫孵育3 h，加Ⅱ抗室溫孵育1.5 h，DAB顯色。

5 流式細胞術檢測

采用細針頭刺入淋巴結或脾臟，再向組織內注入細胞培養基，將細胞沖出，然后用塑料針芯鈍端在培養基中輕壓組織，最后通過不銹鋼篩網(孔徑75 μm)過濾制成單細胞懸液，脾臟組織制成的單細胞懸液再加入紅細胞裂解液，反復沖洗2次。APC－conjugated anti－mouse Foxp3、FITC－conjugated anti－mouse CD4和PE－conjugated anti－mouse CD25 3種抗體用以標記Tregs，操作按說明書步驟進行。

6 實時定量PCR檢測

通過Trizol試劑從淋巴結和脾臟組織抽提總RNA，按照RT－PCR kit的操作步驟合成cDNA。應用SYBR green染料法，通過ABI7000定量PCR儀檢測，擴增條件:95℃變性60 s，95℃15 s，60℃15 s，72℃ 45 s，進行40個循環。引物如下:小鼠Foxp3，5′－GGG AGC AGT GTG GAC CGT AG－3′，5′－CCA CAG CCT CAG TCT CAT GGT－3′;小鼠β－actin，5′－CTT CAA CAC CCC AGC CAT GT－3，5′－TGG CGT GAG GGA GAG CAT AG－3′。結果根據目標基因相對于內參照 β －actin的△Ct值 = 2－(Ct［Foxp3］﹣Ct［β－actin］)進行分析。

7 ELISPOT檢測

按上述方法從淋巴結和脾臟制成的單細胞懸液(8×106－1×107cells)加入6孔板或預包被anti－CD3抗體的6孔板中，每孔2 mL RPMI－1640培養基(含10%FBS、2 mmol/L L－glutamine、25 mmol/L Hepes、100 mg/L penicillin G和1×105U/L streptomycin)，置入37℃、5%CO2培養箱內培養48 h后收集淋巴細胞并計數，然后在小鼠IFN－γ ELISPOT試劑盒96孔板中進行細胞種板，重復3孔，設陰性和陽性對照孔，按試劑盒操作說明依次加入生物素化檢測抗體(biotinylated detection Ab)、抗生蛋白鏈菌素堿性磷酸酶(streptavidin－alkaline phosphatase)和BCIP/NBT發色團(BCIP/NBT chromagen)，每步驟之間均以沖洗液反復沖洗，37℃烤干30 min后應用ImmunoSpot Series 3B Analyzer(CTL，Cleveland，OH)進行斑點計數并分析，數據結果以1×106接種細胞中形成IFN－γ斑點細胞數(IFN－γ spot－forming cells，SFCs)表示。實驗設定≥30 IFN－γ SFC/ 106cells為特異性淋巴細胞分泌反應陽性，與評估人外周血單個核細胞(PBMCs)對記憶抗原刺激陽性反應的標準一致［9］。

8 統計學處理

結果

1 小鼠足掌腫瘤生長速度和TDLNs組織學改變

Hepa1－6細胞接種小鼠足掌皮下后第4 d可見足掌中心局部稍隆起，呈暗紫褐色，此后足掌腫瘤逐漸增大。第12 d腫瘤長徑達5 mm(圖1A)，重量為(0.0614 ± 0.0250)g，同時腫瘤側腘淋巴結(TDLNs)重量為(0.0042±0.0002)g，明顯大于對側腘淋巴結［(0.0007±0.0001)g，P<0.01］和足掌注射LPS組小鼠炎性腘淋巴結的重量［(0.0009± 0.0001)g，P<0.01］，且體積較腫瘤同側的腹股溝淋巴結大(圖1B)。HE染色鏡下見TDLNs內淋巴細胞密集，生發中心擴增，未見淋巴結中心髓竇擴大和淋巴液增多現象(圖4A)。

2 TDLNs中CD4+T細胞和CD8+T細胞擴增

除TDLNs體積較正常腘淋巴結明顯增大外，免疫組化顯示 TDLNs的髓質和副皮質區 CD4+和CD8+兩類T淋巴細胞數量明顯增多(圖4B、C)。

Figure 1.Growth curve of Hepa1－6 tumor after Hepa1－6 footpad challenge.A:footpad tumor largest dimension was measured every three days after Hepa1－6 cells(6×105cells)were injected s.c.into the footpad of right hind limb of each mouse(n= 20);B:representative photographs of tumor－draining lymph nodes(popliteal lymph nodes)(black arrow)and inguinal lymph nodes(white arrow)12 d after inoculation;C:representative photographs of draining popliteal lymph nodes(black arrow)and inguinal lymph nodes(white arrow)two days after LPS footpad injection.圖1 小鼠足掌腫瘤生長曲線和腘淋巴結、腹股溝淋巴結大小改變

3 Foxp3+Tregs在TDLNs中聚集

Figure 2.Analysis of CD4+Foxp3+T cell frequency.A representative flow cytometry data showed the frequency of CD4+lymphocytes and CD4+Foxp3+T cells in the popliteal lymph nodes(TDLN)，inguinal lymph nodes and spleen，which were obtained from two mice 12 d after Hepa1－6 inoculation.Frequency of CD4+ Foxp3+T cells after tumor inoculation respectively was 13.32%，10.88%and 11.86%of total CD4－positive cells.Frequency of CD4+CD25+T cells(data not shown)was slightly higher than that of CD4+ Foxp3+T cells because CD4+CD25+Foxp3+T cells were really Tregs.圖2 腫瘤引流腘淋巴結、同側腹股溝淋巴結及脾臟組織中CD4+CD25+Foxp3+T細胞流式細胞儀分析

轉錄因子Foxp3是Tregs的特異標志［10］。流式細胞分析顯示TDLNs中CD4+CD25+Foxp3+T細胞占CD4+T細胞總數的13.32%，大于在腹股溝淋巴結(10.88%)和脾臟(11.86%)中的比例，見圖2。實時定量PCR結果顯示小鼠TDLNs內Foxp3 mRNA表達水平明顯高于同側腹股溝淋巴結(0.01393± 0.00283 vs 0.01045±0.00308;P<0.01)和脾臟(0.01393±0.00283 vs 0.01039±0.00362;P< 0.01)，而腹股溝淋巴結和脾臟之間的表達水平無顯著差異(P>0.05)。荷瘤小鼠TDLNs和脾臟Foxp3 mRNA的表達水平明顯高于足掌注射LPS的對照組小鼠炎性腘淋巴結(0.01393±0.00283 vs 0.00743± 0.00378;P<0.01)和脾臟(0.01039±0.00362 vs 0.00549±0.00383;P<0.01)的表達水平，見圖3。荷瘤小鼠TDLNs、同側腹股溝淋巴結和脾臟免疫組化染色的結果顯示Foxp3定位于細胞核，Foxp3陽性細胞彌散分布于T細胞區，與淋巴結內CD8+T細胞分布區域基本一致。與同側腹股溝淋巴結和脾臟相比，TDLNs內的Foxp3陽性細胞數量最多，見圖4D、E、F。

Figure 3.Foxp3 expression in lymph nodes and spleen.Relative quantity of Foxp3 mRNA by real－time PCR using the ΔCt method(n=20)in draining lymph nodes and spleen 12 d after Hepa1－6 footpad inoculation or 2 d after LPS footpad injection.**P<0.01 vs popliteal LNs in Hepa1－6－inoculated mice;##P<0.01 vs spleen in LPS－injected mice.圖3Foxp3 mRNA表達實時定量PCR結果

Figure 4.Representative features of CD4+，CD8+，or Foxp3+T lymphocytes in TDLNs(popliteal lymph nodes)and Foxp3+T lymphocytes in inguinal lymph nodes and spleen after Hepa1－6 inoculation(A，B，C，×100);(D，E，F，×200).TDLN(AD)，inguinal lymph nodes(E)and spleen(F).HE staining(A)and immunostaining for CD4(B)，CD8(C)，and Foxp3(D，E，and F).圖4 CD4，CD8和Foxp3免疫組織化學染色

4 Treg抑制TDLNs內CD8+T細胞分泌IFN－γ的功能

由淋巴結和脾臟制成的單個淋巴細胞懸液經過單純培養基培養或anti－CD3抗體刺激激活后種板觀察顯示:荷瘤小鼠TDLNs、同側腹股溝淋巴結和脾臟分泌IFN－γ的細胞計數分別為2、0和0 IFN－γSFC/106cells。經anti－CD3抗體激活處理后，荷瘤小鼠TDLNs、同側腹股溝淋巴結和脾臟分泌IFN－γ的細胞計數上升為179、54和13 IFN－γ SFC/106cells，而足掌注射LPS的炎性腘淋巴結、同側腹股溝淋巴結和脾臟分泌IFN－γ的細胞計數分別為6、19和20 IFN－γ SFC/106cells，見圖5。

Figure 5.Detection of CD8+T cells by IFN－γ ELISPOT in the draining lymph nodes and spleen(n=10).The same pool of lymphocytes were plated 48 h after single－cell suspension from popliteal lymph nodes(A，D，G)，inguinal lymph nodes(B，E，H)，and spleen(C，F，I)was stimulated via anti－CD3 Ab or was cultured in the absence of anti－CD3 stimulation. Representative wells were shown after plate development and spots quantified by automated digital image analysis.Responses are reported as SFC/106input cells.圖5 ELISPOT觀測CD8+T細胞IFN－γ分泌功能

討論

研究證實腫瘤可以使 TDLNs內高內皮靜脈(HEV)被重構改造成血管、淋巴竇增多并擴張和淋巴液增加等結構和功能改變［11，12］，而我們建立的小鼠Hepa1－6肝細胞癌腫瘤引流腘淋巴結內未發現明顯的類似結構改變，而主要表現為淋巴細胞擴增聚集，提示不同腫瘤細胞系發生區域淋巴結轉移的潛能存在差異，因此可能引起TDLNs不同的形態結構改變。

我們的研究顯示TDLNs重量與體積明顯大于足掌注射LPS的炎性腘淋巴結，CD4+和CD8+2類T淋巴細胞在TDLNs中明顯擴增，表明TDLNs內發生了與炎癥引流淋巴結不同程度或特征性的免疫應答反應。

腫瘤進展引起TDLNs中的Tregs和抗腫瘤效應性T細胞被初始化，兩者之間的相互作用決定了TDLNs的免疫狀態［13］。臨床研究顯示Tregs在調控機體對肝細胞癌的免疫反應中發揮關鍵作用，其具有的免疫抑制效應使 TILs功能低下［4，14，15］。表達Foxp3是Tregs的基本特征，同時也是鑒別Tregs的特異標志［16］。我們的研究發現隨著肝細胞癌逐漸生長成瘤，Foxp3+Tregs首先聚集于TDLNs，數量明顯增加，而非TDLNs(腹股溝淋巴結)和脾臟中卻無Tregs數量擴增現象，提示TDLNs在形成機體對腫瘤免疫耐受的過程中是一個啟動位點。已有研究發現移植耐受條件下Tregs聚居外周淋巴結內而非脾臟對于主動維持移植物耐受是必需的［17］。體外實驗表明培養的肝細胞癌細胞系上清液導致CD4+CD25+調節性T細胞擴增且抑制功能增強［18］。因此我們認為引流進入TDLNs的腫瘤抗原或腫瘤分泌因子可能誘導天然的Tregs擴增或Tregs由CD4+T細胞新生而來。

腫瘤主動地改變了腫瘤引流淋巴結的免疫微環境，表現為 Tregs較均勻彌散地分布于 CD4+或CD8+T細胞聚居的副皮質和髓質區。這種分布方式促使細胞間直接相互接觸，進而Tregs通過表達CD86和CD4+效應T細胞的CTLA－4相互作用而抑制其發揮效應功能［13］，然而有研究認為Tregs表達并分泌TGF－β是抑制CD8+T細胞功能的一種機制［19，20］，我們的研究顯示Tregs彌散分布模式也符合細胞因子局部發揮作用的特性，因而可以認為Tregs分泌的細胞因子影響其周圍的CD8+T細胞的功能。CD8+T細胞在抗腫瘤免疫中具有至關重要的作用，我們的研究發現TDLNs中CD8+T細胞的功能受到了抑制，這種抑制并未使CD8+T細胞徹底喪失效應功能，在一定的條件下CD8+T細胞仍可對外界刺激產生應答并恢復分泌IFN－γ能力。因此，消除TDLNs內Tregs對特異性抗腫瘤效應細胞的抑制，打破Tregs維持的TDLNs免疫耐受環境或TDLNs的效應細胞在體外經短期激活和擴增用于過繼免疫治療可能成為一種有效的腫瘤免疫治療新途徑。

［1］ Bruix J，Llovet JM.Major achievements in hepatocellular carcinoma［J］.Lancet，2009，373(9664):614－616.

［2］ Butterfield LH.Recent advances in immunotherapy for hepatocellular cancer［J］.Swiss Med Wkly，2007，137(5－6):83－90.

［3］ Wada Y，Nakashima O，Kutami R，et al.Clinicopathological study on hepatocellular carcinoma with lymphocytic infiltration［J］.Hepatology，1998，27(2):407－414.

［4］ Unitt E，Rushbrook SM，Marshall A，et al.Compromised lymphocytes infiltrate hepatocellular carcinoma:the role of T－regulatory cells［J］.Hepatology，2005，41(4):722－730.

［5］ Sakaguchi S.Regulatory T cells:key controllers of immunologic self－tolerance［J］.Cell，2000，101(5):455－458.

［6］ Zou W.Regulatory T cells，tumor immunity and immunotherapy［J］.Nat Rev Immunol，2006，6(4):295－307.

［7］ Curiel TJ.Regulatory T cells and treatment of cancer［J］. Curr Opin Immunol，2008，20(2):241－246.

［8］ Munn DH，Mellor AL.The tumor－draining lymph node as an immune－privileged site［J］.Immunol Rev，2006，213:146－158.

［9］ Currier JR，Kuta EG，Turk E，et al.A panel of MHC class I restricted viral peptides for use as a quality control for vaccine trial ELISPOT assays［J］.J Immunol Methods，2002，260(1－2):157－172.

［10］Fontenot JD，Gavin MA，Rudensky AY.Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells［J］.Nat Immunol，2003，4(4):330－336.

［11］Qian CN，Berghuis B，Tsarfaty G，et al.Preparing the“soil”:the primary tumor induces vasculature reorganization in the sentinel lymph node before the arrival of metastatic cancer cells［J］.Cancer Res，2006，66(21): 10365－10376.

［12］Harrell MI，Iritani BM，Ruddell A.Tumor－induced sentinel lymph node lymphangiogenesis and increased lymph flow precede melanoma metastasis［J］.Am J Pathol，2007，170(2):774－786.

［13］Hiura T，Kagamu H，Miura S，et al.Both regulatory T cells and antitumor effector T cells are primed in the same draining lymph nodes during tumor progression［J］.J Immunol，2005，175(8):5058－5066.

［14］Ormandy LA，Hillemann T，Wedemeyer H，et al.Increased populations of regulatory T cells in peripheral blood of patients with hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Res，2005，65(6):2457－2464.

［15］Kobayashi N，Hiraoka N，Yamagami W，et al.Foxp3+regulatory T cells affect the development and progression of hepatocarcinogenesis［J］.Clin Cancer Res，2007，13 (3):902－911.

［16］陳莉娟，周 浩，朱劍文，等.Foxp 3轉染小鼠CD4+CD25－T細胞抑制NK細胞活性［J］.中國病理生理雜志，2009，25(6):1151－1155.

［17］Ochando JC，Yopp AC，Yang Y，et al.Lymph node occupancy is required for the peripheral development of alloantigen－specific Foxp3+regulatory T cells［J］.J Immunol，2005，174(11):6993－7005.

［18］Cao M，Cabrera R，Xu Y，et al.Hepatocellular carcinoma cell supernatants increase expansion and function of CD4+CD25+regulatory T cells［J］.Lab Invest，2007，87 (6):582－590.

［19］Chen ML，Pittet MJ，Gorelik L，et al.Regulatory T cells suppress tumor－specific CD8 T cell cytotoxicity through TGF－beta signals in vivo［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(2):419－424.

［20］Somasundaram R，Jacob L，Swoboda R，et al.Inhibition of cytolytic T lymphocyte proliferation by autologous CD4+/CD25+regulatory T cells in a colorectal carcinoma patient is mediated by transforming growth factor－beta［J］.Cancer Res，2002，62(18):5267－5272.