年輕骨髓間充質干細胞可通過細胞融合改善年老骨髓間充質干細胞功能*

黎 佼， 陳敏生， 楊偉健， 張振輝， 鐘 赟， 劉世明

(廣州醫學院第二附屬醫院心內科，廣州心血管疾病研究所，廣東廣州510260)

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)對間充質組織功能的維持和修復起重要作用。多項實驗和臨床研究表明:BMSCs具有分化與修復心肌組織的潛力，能夠改善心功能。干細胞在修復心肌治療中起重要作用。與年齡相關的心腦血管疾病以及肝臟、皮膚和骨骼等器官或組織的退行性疾病的發生，可能與干細胞數量減少和功能下降有關。近幾年研究發現年老供體來源與年輕供體來源干細胞相比，細胞功能下降［1］。供體骨髓干細胞的年齡因素可能是影響心肌梗死后干細胞修復心肌效果的重要因素。最近細胞融合機制成功解釋了骨髓來源的干細胞通過細胞融合如何使病變的肝臟細胞、心肌細胞等細胞再生。本研究探討了年輕BMSCs通過細胞融合對年老BMSCs功能的影響及其意義。

材料和方法

1 主要試劑

細胞培養粉(iscove's modified Dulbecco's medium，IMDM)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、細胞培養液 (Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)均購自 Gibco;氨芐青霉素、硫酸鏈霉素、PKH26試劑盒、異丁基甲基黃嘌呤、EDTA、胰島素、地塞米松、吲哚美辛、油紅O染色劑、VitC、β磷酸甘油鈉、茜素紅染色劑均購自 Sigma;大鼠抗小鼠CD44、Sca－1、CD34、CD117、CD31、CD45單克隆抗體及羊抗鼠 IgG AlexaFluor 633抗體均購自 BD Pharmingen;DAPI核酸染色劑購自Invitrogen;聚乙烯二醇購自Roche。

2 動物

年輕普通C57BL/6小鼠、年輕綠色熒光蛋白轉基因 C57BL/6小鼠、年輕紅色熒光蛋白轉基因C57BL/6小鼠(2－3月齡);年老普通C57BL/6小鼠、年老綠色熒光蛋白轉基因C57BL/6小鼠(18－24月齡)，均由Tac提供。

3 小鼠BMSCs的分離和培養

小鼠麻醉處死后，在無菌條件下取出股骨，將骨髓沖出至無菌管中，將骨髓吹打均勻，制成細胞懸液，加入25 mL含10%FBS的IMDM培養液，接種于175 cm2培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱中常規培養，3 d后用PBS液洗掉非貼壁細胞，換培養液繼續培養，細胞長滿80%時用0.25%胰酶消化傳代培養。

4 細胞融合

實驗分為5組:(1)年輕BMSCs組(young，Y); (2)年老BMSCs組(old，O);(3)PKH26標記的年輕BMSCs和綠色熒光蛋白轉基因年輕BMSCs融合組(Y－Y);(4)PKH26標記的年輕BMSCs和綠色熒光蛋白轉基因年老BMSCs融合組 (Y－O);(5) PKH26標記的年老BMSCs和綠色熒光蛋白轉基因年老BMSCs融合組(O－O);取C57BL/6小鼠第3代BMSCs，按 PKH26染色說明書操作。取 1× 107cells 1 200 r/min離心5 min，用IMDM培養液洗滌細胞1次，加0.5 mL稀釋劑C(PKH26試劑盒配套試劑)重懸細胞。將BMSCs懸液快速加至混合染料應用液中(2 μL PKH26加0.5 mL稀釋劑C)混勻，在25℃無菌條件下孵化5 min，期間輕柔翻轉離心管以確保混勻;加1 mL FBS終止染色，25℃孵化1 min，再加2 mL含10%FBS的IMDM培養液稀釋。1 200 r/min離心10 min，轉移細胞至另一離心管。含10%FBS的IMDM培養液洗滌3次后，進行細胞計數。取不同年齡組等量BMSCs混合離心后，用IMDM培養液洗滌細胞1次，去上清，1 min內緩慢加入37℃預熱的PEG 1500(90 μL/1×106cells)，邊滴邊混勻細胞1 min。4 min內緩慢加入4 mL 37℃預熱的含10%FBS的IMDM培養液，邊滴邊混勻細胞。加入10 mL 37℃預熱的含10%FBS的IMDM培養液37℃孵化5 min后離心，進行細胞計數。置于37℃、5%CO2培養箱中常規培養，24 h后換入新鮮含10%FBS的IMDM培養液，培養7 d。

5 融合細胞的鑒定和形態觀察

取融合后培養7 d的BMSCs，1 200 r/min離心5 min，PBS洗滌2次，將細胞重懸于500 μL PBS中，經流式細胞儀檢測細胞膜表面熒光蛋白的表達。取融合后培養7 d的BMSCs及普通BMSCs，1 200 r/min離心5 min，用冷清洗液(含1%FBS的PBS)洗滌2次，分別滴加大鼠抗小鼠抗體CD44(1∶50)、Sca－1 (1∶20)、CD34(1∶50)、CD117(1∶50)、CD31(1∶400)、CD45(1∶40)混勻后4℃反應60 min;冷清洗液洗2次，加入羊抗鼠IgG抗體(1∶200)4℃反應60 min，低溫離心5 min棄上清;冷PBS洗2次，流式細胞儀檢測，存取數據后分析。年輕綠色熒光蛋白轉基因C57BL/6小鼠與年輕紅色熒光蛋白轉基因C57BL/6小鼠BMSCs融合，分別培養7 d、14 d、21 d，用DAPI對細胞核染色，在免疫熒光顯微鏡下觀察細胞形態及細胞核特征。

6 細胞增殖能力檢測

將5組細胞分別接種于直徑35 mm的培養皿中(1×103cells/cm2)。在第1、2、4、6、8 d，胰酶消化細胞，血細胞計數儀對細胞進行計數。

7 BMSCs成骨細胞分化能力檢測

將5組細胞分別接種于直徑35 mm的培養皿中(1×103cells/cm2)。細胞在含10%FBS的IMDM培養液中培養24 h后，換誘導液培養，每3 d換1次液，培養3周。誘導液為1×10－4mmol/L地塞米松，0.05 mmol/L VitC，10 mmol/L β磷酸甘油鈉，含10%FBS低糖DMDM培養液。3周后細胞用PBS洗滌1次，70% 冰乙醇固定1 h。茜素紅室溫染色10 min后蒸餾水洗滌。在顯微鏡下，每個培養皿隨機選取3個區域，用Image J軟件對染色陽性區域進行定量分析。

8 BMSCs脂肪細胞分化能力檢測

將5組細胞分別接種于直徑35 mm的培養皿中(1×103cells/cm2)。細胞在含10%FBS的IMDM培養液中培養24 h后，換誘導液培養，每3 d換1次液，培養3周。誘導液為含1×10－3mmol/L地塞米松、0.5 mmol/L異丁基甲基黃嘌呤、0.01 mmol/L胰島素、0.2 mmol/L吲哚美辛的含10%FBS的DMDM培養液。3周后細胞用PBS洗滌1次，4%多聚甲醛固定10 min，60%異丙醇洗滌1次，油紅O室溫染色5 min后，60%異丙醇及蒸餾水各洗滌1次。在顯微鏡下，每個培養皿隨機選取3個區域，用Image J軟件對染色陽性區域進行定量分析。

9 統計學處理

結果

1 細胞融合率測定

PKH26標記的普通小鼠BMSCs細胞膜表達紅色熒光，綠色熒光蛋白轉基因小鼠BMSCs細胞膜表達綠色熒光。紅色熒光及綠色熒光均表達的為融合細胞。以融合細胞數除以觀察的總細胞數即為細胞融合率。細胞融合率百分數可達30.45%±4.13%，3組融合組間無顯著差異［(29.41% ±3.00%)vs(30.54± 1.20%)vs(31.41%±6.63%)，P>0.05］，見圖1。

Figure 1.The fusion rate(%)of the three fusion groups detected by flow cytometry.Young(Y，2－3 months)and old(O，18－24 months)C57BL/6 mice BMSCs labeled with PKH26 membrane fluorescent kit were fused with young and old GFP transgenic C57BL/6 mice BMSCs by using PEG 1500.30.45%±4.13%fusion cells were obtained，and there were no significant difference in the fusion rate from three groups(Y－Y group，Y－O group，O－O group).±s.n=7.圖1 流式細胞儀檢測細胞融合率

2 融合細胞形態特征及表面抗原表達

免疫熒光顯微鏡下紅色熒光及綠色熒光均表達的為融合細胞(黃色)。誘導融合培養7 d時，可見正在融合的雙核或已完全融合的單核融合細胞;培養14 d及21d時只見已完全融合的單核融合細胞，見圖2。流式細胞儀檢測普通BMSCs及融合BMSCs表面特異性抗原表達結果顯示，表達BMSCs特異性抗原CD44(94.48%±2.20%)、Sca－1(79.70% ± 1.10%)，而不表達造血干細胞表面特異性抗原CD34(1.22%±0.28%)、CD117(0.23%±0.10%)、CD31(1.43%±0.22%)、CD45(0.41%±0.10%)，見圖3。

Figure 2.Morphology and nuclear characteristics of fusion cells were detected by fluorescence microscopy(×400).Fusing cells(two nuclears)and fused cells(one nuclear)can be found at 7 d;only fused cells can be found at 14 and 21 d.Blue(DAPI)，green(GFP cell)，red(RFP cell)，yellow(fusion cell).圖2 熒光顯微鏡觀察融合細胞形態學特征

Figure 3.Cell surface markers were detected by flow cytometry.Fusion BMSCs coincided with the normol BMSCs were reactive to the BMSCs lineage－specific CD44，Sca－1 surface markers(A)and negative for the hematopoietic stem cells(HSCs)lineage－specific surface markers such as CD34，CD117，CD31，CD45(B).±s.n=4.圖3 流式細胞儀檢測細胞表面特異性抗原表達

3 細胞增殖能力檢測

在2 d、4 d、6 d、8 d，Y組細胞增殖能力均比O組強，細胞增加百分率具體數值為:(145.15% ± 8.25%)vs(105.09% ±5.58%)、(251.83% ± 10.62%)vs(154.05% ±11.18%)、(397.27% ± 32.44%)vs(256.52% ±20.52%)、(555.68% ± 31.09%)vs(367.71% ±18.71%)，P<0.05。Y－O組細胞數量增加百分率比O－O組均顯著增高，分別為:(122.20% ±4.60%)vs(104.64% ±1.25%)、(213.25% ±15.29%)vs(130.02% ±6.82%)、 (318.46% ±19.86%)vs(179.40% ±9.54%)、(439.98%±24.09%)vs(240.03%±28.07%)，P< 0.05。Y－Y組與Y組、O－O組與O組細胞增殖能力無顯著差異，見圖4。

4 成骨細胞分化能力檢測

Y組成骨細胞分化能力比O組強，茜素紅染色陽性百分率為:(30.55% ±3.18%)vs(16.25% ± 2.70%)，P<0.01。Y－O組茜素紅染色陽性百分率比 O－O組顯著增高:(25.46% ±1.52%)vs (13.85%±1.69%)，P<0.01。Y－Y組與Y組、O－O組與O組成骨細胞分化能力無顯著差異，見圖5。

Figure 4.The percentage of increase cell number of five groups. At d 2，4，6，and 8，Y group compared to O group and Y－O group compared to O－O group were significantly greater.Y vs O were(145.15%±8.25%)vs (105.09% ±5.58%);(251.83% ±10.62%)vs (154.05% ±11.18%);(397.27% ±32.44%)vs (256.52% ±20.52%);(555.68% ±31.09%)vs (367.71% ±18.71%);Y－O vs O－O were (122.20% ±4.60%)vs(104.64% ±1.25%); (213.25% ±15.29%)vs(130.02% ±6.82%); (318.46% ±19.86%)vs(179.40% ±9.54%); (439.98%±24.09%)vs(240.03%±28.07%).±s.n=3.*P<0.05 vs O，Y－O vs O－O.圖4 細胞增殖能力檢測

Figure 5.Osteogenic differentiation potential of five groups.The positive area(×40)stained with Alizarin red shows significantly higher in Y group as compared to O group (30.55% ±3.18%)vs(16.25% ±2.70%)，and Y－O group as compared to O－O group(25.46% ± 1.52%)vs(13.85% ±1.69%).±s.n=3.**P <0.01 vs O group;##P<0.01 vs O－O group.圖5 成骨細胞分化能力檢測

5 脂肪細胞分化能力檢測

Y組脂肪細胞分化能力比O組強，油紅O染色陽性百分率為:(14.46% ±2.63%)vs(6.52% ± 2.35%)，P<0.05。Y－O組油紅O染色陽性百分率比 O－O組顯著增高:(12.99% ±2.61%)vs (6.03%±1.71%)，P<0.05。Y－Y組與Y組、OO組與O組脂肪細胞分化能力無顯著差異，見圖6。

Figure 6.Adipogenic differentiation potential of five groups.The positive area stained with oil red(×200)shows significantly higher in Y group as compared to O group (14.46%±2.63%)vs(6.52% ±2.35%)，and Y－O group as compared to O－O group(12.99% ± 2.61%)vs(6.03%±1.71%).±s.n=3.*P< 0.05 vs O group;#P<0.05 vs O－O group.圖6 脂肪細胞分化能力檢測

討論

BMSCs作為具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞，有著非常重要的理論研究意義和臨床應用價值，廣泛用于干細胞移植、損傷器官修復、基因治療等研究［2，3］。衰老是多細胞生物機體功能退變的過程，一般隨著年齡的增長，體細胞逐漸出現自我更新能力的降低和功能紊亂。BMSCs隨著供體年齡的增加，也相應出現結構和功能的改變，細胞形態變大、變長，細胞集落形成單位的數量下降，細胞增殖能力、成骨細胞、脂肪細胞及成軟骨細胞分化能力下降［4］，細胞端粒酶變短以及轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF－β)［5］、白細胞介素－6 (interleukin－6，IL－6)、白細胞介素－11(interleukin－11，IL－11)等細胞因子、生長因子及酶類功能下降。

細胞融合是近30年來迅速發展起來的細胞工程技術，是指細胞通過介導和培養，在離體條件下用人工方法將不同種的細胞通過無性方式融合(合并)成1個核或多核的雜合細胞的過程。雜合細胞得到了來自2個細胞的遺傳物質(細胞核核外和染色體組合基因)，具有新的遺傳或生物特性。最近的研究發現，體外培養的干細胞可以發生自身融合［6］，骨髓干細胞可與浦肯野神經元細胞、心肌細胞［7］、小腸干細胞融合，骨髓干細胞通過分化和細胞融合修復內皮細胞，骨髓干細胞通過細胞融合可使肝臟細胞再生［8］，細胞融合被認為是使細胞功能恢復的1種有效方法。

通過本實驗，我們發現:(1)在其它條件相同的情況下，隨著年齡的增長，BMSCs增殖功能、成骨細胞及脂肪細胞分化功能明顯減退;(2)年輕與年老BMSCs通過PEG誘導融合后，能保持干細胞的特性;(3)年輕BMSCs可通過細胞融合改善年老BMSCs增殖功能、成骨細胞及脂肪細胞分化功能。我們認為其可能的機制包括以下3種:(1)年輕BMSCs改善了年老BMSCs端粒酶功能:有研究發現端粒酶可能通過延長端粒的長度恢復其再生和復制功能［9］。年輕BMSCs與年老BMSCs細胞核的融合可能改善了年老BMSCs端粒酶功能，從而改善其增殖及分化功能;(2)年輕BMSCs改變了年老BMSCs細胞因子或基因的表達:有研究發現干細胞成骨細胞及脂肪細胞分化功能與TGF－β、骨形成蛋白－2/4 (bone morphogenetic protein 2/4，BMP2/4)等細胞因子或基因的表達相關［3］。融合后細胞因子或基因表達等的改變可能改善了年老BMSCs多樣分化功能; (3)年輕BMSCs改變了年老BMSCs細胞內外微環境:有研究發現干細胞再生功能受周圍環境的影響［10］，年輕祖細胞微環境可促使年老祖細胞再生［11］。年輕 BMSCs內外微環境可能促進了融合BMSCs的增殖及分化。本研究尚未包括此方面的內容，這些研究只是初步的結果，尚不完整，但對將來的研究提供有益的線索和基礎。

綜上所述，年齡的增加是導致干細胞功能的重要因素，隨著年齡的增加，干細胞的增殖和分化功能減退。通過聚乙烯二醇可建立年輕及年老骨髓間充質干細胞融合模型。通過細胞融合，年輕骨髓間充質干細胞改善了年老骨髓間充質干細胞的增殖功能及成骨細胞、脂肪細胞分化功能。這對干細胞再生能力研究及干細胞移植的臨床治療提供了更多的途徑和依據。

(致謝:本實驗在加拿大Toronto General Research Institute完成，感謝李曙紅老師的悉心指導。)

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