河南漢族人群同胞兄弟短串聯重復序列多態性測定

李 楊,孫 莉,李曉文#,陳 輝

1)鄭州大學基礎醫學院細胞生物學與醫學遺傳學教研室鄭州 450001 2)鄭州大學第一附屬醫院檢驗科鄭州 450052

#通訊作者,女,1955年生,本科,教授,研究方向:遺傳病分子機制與基因診斷,E-mail:lixaowen@zzu.edu.cn

短串聯重復序列(short tandem repeat,STR)的重復單位長2～6 bp,STR在整個人類基因組中分布廣泛,目前是法醫DNA分析中最常用的一類遺傳標記[1]。在日常檢案中,除常見的標準三聯體和二聯體鑒定外,有時因父母已故或因某種原因不能參與鑒定,當事人便會要求進行同胞兄弟間的血緣鑒定。作者將7個Y染色體STR(Y-STR)位點(DYS19、DYS385、DYS389Ⅰ、DYS389Ⅱ、DYS390、A7.1和H4)和13個常用的常染色體STR位點(CSFIPO、TPOX、THOI、F13AOI、VWA、D16S539、D7S820、D13S317、 D18S51、D3S1358、D21S11、D8S1179和D5S818)聯合運用于同胞兄弟鑒定,探討其可行性以指導實踐。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 隨機抽取來自河南漢族不同家系的80對同胞(包括 34對兄弟)和 80對無關個體(包括51對男性無關個體)的外周血樣各2mL,EDTA抗凝,-20℃保存。

1.2 DNA提取 常規苯酚-氯仿抽提法提取DNA。

1.3 PCR擴增及產物分離 所有檢材(即80對同胞和80對無關個體)均擴增13個常染色體STR基因位點。34對兄弟和 51對男性無關個體擴增 7個Y-STR基因位點。常染色體復合位點擴增反應體系見表1,擴增條件:96℃預變性2min;94℃1 min, 60℃1min,70℃1.5min,共10個循環;以后90℃1 min,60℃1min,70℃1.5 min,共20個循環;最后60℃延伸30min,4℃保存。Y-STR位點擴增反應體系見表 2、表 3。DYS389Ⅰ、DYS389Ⅱ和DYS390擴增條件:94℃預變性3min;94℃15 s,58℃20 s,72℃20 s,共5個循環;94℃15 s,54℃20 s,72℃20 s,共30個循環;72℃延伸10min,4℃保存。A7.1和H4擴增條件:95℃預變性5 min;94℃45 s,61℃45 s,72℃45 s,共30個循環;72℃延伸5 min,4℃保存。DYS385擴增條件:94℃預變性3 min;94℃30 s,59℃30 s,72℃1 min,共2個循環;94℃30 s,57℃30 s,72℃1min,共2個循環; 94℃30 s,56℃30 s,72℃1min,共29個循環;72℃延伸10 min,4℃保存。DYS19擴增條件:95℃預變性12min;94℃1min,60℃1m in,72℃1min (每個循環退火溫度依次降低0.5℃);94℃1min, 56℃1min,72℃1min,共30個循環;72℃終延伸10min,4℃保存。Y-STR引物序列從STRBase(http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase)查找,常染色體STR位點引物均來自基因組數據庫。擴增產物用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,銀染顯示電泳結果,根據等位基因梯階對照命名等位基因。

表1 常染色體STR復合擴增體系

表2 DYS390、DYS389Ⅰ/Ⅱ和A 7.1、H 4復合擴增體系

1.4 觀測指標 計算7個Y-STR位點的單倍型多樣性;用ITO法計算13個常染色體STR位點的同胞組和無關個體組的同胞關系指數(PIFS)[2],并按公式W=PI/(PI+1)分別計算同胞關系概率(WFS),式中 W為父權概率,PI為親權指數[2-3];分析每對同胞在7個Y-STR位點和在常染色體STR位點等位基因的匹配情況。

表3 DYS19、DYS385復合擴增體系

1.5 同胞關系判斷方法 以同胞組與無關個體組全相同基因數或全不同基因數無重疊為標準,即全相同數≥5或全不同數≤1提示為同胞關系,全不同數≥6或全相同數≤0提示為無關個體。

1.6 統計學處理 采用SPSS 10.0對常染色體STR位點等位基因匹配結果行兩獨立樣本的秩和檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 Y-STR位點的單倍型分析 34對兄弟的7個Y-STR基因位點均相同,51對無關男性個體中 2、3、4、5和 6個基因位點不同的個體對數分別為 2、5、13、14和 14例,7個基因位點全不同者 3例,7個 YSTR位點的單倍型多樣性為0.999 233。同胞組中A6/B6與 A7/B7的單倍型完全一致,均為 11/12-13/12/29/23/11/11(表 4);非同胞組中單倍型 12/ 12-17/13/30/24/11/12出現 3次,單倍型 11/13-18/ 11/27/24/10/11出現 2次。

2.2 13個常染色體STR位點基因匹配結果 同胞組中13個常染色體STR位點PIFS值為0.049 6-1.667×108,WFS值為96.064%;無關個體組中13個常染色體STR位點PIFS值為6.143×10-6-3.535, WFS值為 3.544%。80對同胞與 80對無關個體 13個常染色體位點等位基因匹配結果見表 5。

2.3 同胞關系判斷結果 以13個常用的常染色體STR位點檢測 51對男性無關個體和 34對兄弟,同胞兄弟中有5對不能判斷,分別為 A11/B11、A25/B25 (全相同基因數為 3,全不同基因數為 3),A20/B20、A30/B30(全相同基因數為 4,全不同基因數為 2), A24/B24(全相同基因數為 3,全不同基因數為 2)。在無關個體組中 15例不能判斷,分別為全相同基因數為 1,全不同基因數為 4的 3例;全相同基因數為3,全不同基因數為 5的 3例;全相同基因數為2,全不同基因數為 4的 2例;全相同基因數為 3,全不同基因數為 3的2例;全相同基因數為 4,全不同基因數為3的 2例;全相同基因數為 2,全不同基因數為 5的 1例;全相同基因數為1,全不同基因數為3的1例;全相同基因數為 1,全不同基因數為 5的 1例。聯合運用這 20個位點僅有 5對同胞不能確定。

表4 同胞兄弟7個Y-STR位點單倍型分析結果(n=80)

表5 13個常染色體STR位點等位基因匹配結果(n=80) 例

3 討論

Y染色體序列結構穩定,除擬常染色質區外,大部分在減數分裂中不出現重組交換,因此以單倍型概率計算。作者選取了 7個常用的分布于擬常染色質區外的Y-STR位點,分析其在男性同胞鑒定中的應用價值。研究結果顯示,7個Y-STR位點單倍型多樣性為0.999 233。但值得注意的是,來自不同家系的同胞對(A6/B6與A7/B7)之間及無關個體之間都有相同單倍型出現,說明無血緣個體的7個Y-STR單倍型也可能完全相同。Y-STR位點是全男性遺傳,較常染色體STR位點應用方便,但多態性普遍不太理想,一般在4～6個等位基因,因此,用較少的Y-STR位點進行親緣關系鑒定有誤判的可能。僅用常染色體STR鑒定同胞兄弟需要檢測大量位點,作者以 13個常染色體STR位點檢測34對同胞和51對無關個體,同胞組與無關個體組仍分別有 5對和 15對不能判斷。聯合運用這 20個位點僅有 5對同胞不能確定。

綜上所述,當僅用常染色體或Y-STR位點鑒定同胞兄弟時,均有誤判可能,如果將7個Y-STR位點和13個常染色體STR位點聯合運用來鑒定同胞兄弟,則可大大增加判斷率。該研究中 Y單倍型相同的無關個體之間及來自不同家系的同胞對(A6/ B6與A7/B7)之間,13個常染色體STR位點全不同位點數均≥6,或全相同數≤0,可以認定為無關個體。而13個常染色體STR位點不能判斷的 5對同胞的7個Y-STR位點單倍體相同,提示可能具有同胞關系,但須增加檢測的基因數目,從而進行確定; 15對無關個體中,7個Y-STR位點中不同基因位點數均≥2,可以確定為無關個體。

同時檢測Y-STR和常染色體STR可有效提高鑒定率,效果遠遠好于僅用其中之一,而且省時省力,應用方便。在實際工作中應采用多少個基因位點可達到最佳效果,有待于進一步探討。

[1]陸惠玲,劉秋玲,臺云春,等.常染色體STR遺傳標記在同胞鑒定中的應用[J].中國法醫學雜志,2003,18(3): 154

[2]陸惠玲,楊慶恩.用 ITO法計算兩個體間的血緣關系機會[J].中國法醫學雜志,2002,17(3):188

[3]鄭秀芬.法醫DNA分析[M].北京:中國人民公安大學出版社,2002:102