粉防己堿對(duì)人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞體外增殖及增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)的影響

孫廣莉,張明昌,蔣 麗

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科鄭州 450052

△女,1977年5月生,博士,主治醫(yī)師,研究方向:眼表疾病,E-mail:sunguangli1@126.com

翼狀胬肉是局部球結(jié)膜纖維血管組織增生侵犯角膜的一種疾病,是臨床上最常見(jiàn)的眼病之一,不僅可引起眼刺激征、外觀(guān)缺陷,還可不同程度地影響視力,但其發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。治療翼狀胬肉的手術(shù)方法較多,但均有一定的復(fù)發(fā)率,治療效果仍不滿(mǎn)意,因此尋找有效、不良反應(yīng)少的治療方法是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。作者觀(guān)察了粉防己堿(tetrandrine, Tet)對(duì)體外培養(yǎng)的人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞(human pterygium fibrob last,HPF)的抑制作用,以尋找輔助治療翼狀胬肉的新方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Tet由浙江金華制藥廠(chǎng)生產(chǎn)(粉劑,純度＞98%),2.5 g/L胰蛋白酶、碘化丙啶(PI)、RNA酶及EDTA Hank's液由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院提供,噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Sigma公司, DMEM培養(yǎng)基及新生牛血清購(gòu)自Gibco公司,小鼠抗人角蛋白、波形蛋白和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)單克隆抗體為武漢博士德公司產(chǎn)品。

1.2 Tet儲(chǔ)存液的配制 以少量DMSO助溶,加入DMEM配制成10mmol/L的貯存液,分裝,-20℃避光保存,2周內(nèi)有效。使用時(shí)用DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

1.3 HPF的培養(yǎng)、鑒定與傳代 胬肉組織標(biāo)本為鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科手術(shù)切除新鮮組織,采用組織塊培養(yǎng)法原代接種 1 d后,觀(guān)察組織塊貼壁情況、培養(yǎng)液色澤、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和形態(tài)特征等。48 h后觀(guān)察有細(xì)胞從組織塊周?chē)莱?每 3～4 d更換1次培養(yǎng)液,待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至 80%后以 2.5 g/L胰蛋白酶消化細(xì)胞,按 1:3分種傳代。取傳代細(xì)胞接種于預(yù)置蓋玻片的 6孔板,待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)蓋玻片,取出用無(wú)水乙醇+冷丙酮(體積比1:1)混合固定15 min,風(fēng)干后 HE染色,并以抗波形蛋白和角蛋白抗體行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。

1.4 Tet對(duì)HPF增殖的影響 采用MTT比色法。HPF細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù) 10%的新生牛血清、100 kU/L青霉素及100 kU/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HPF細(xì)胞按1× 105mL-1接種于 96孔培養(yǎng)板,每孔加液 200μL。設(shè)不接種細(xì)胞的空白組(調(diào)零組)、對(duì)照組和Tet組。24 h后換液,對(duì)照組不加Tet,Tet組Tet終濃度分別為 20、40、80和160μmol/L。每個(gè)濃度每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔。分別于Tet干預(yù)24、48及72 h后加入5 g/LMTT 20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸出培養(yǎng)液,每孔加二甲基亞砜150μL,振蕩溶解10 min,待結(jié)晶完全溶解后,在ELX 800酶標(biāo)儀上選擇波長(zhǎng)490 nm,空白組調(diào)零,測(cè)定各孔吸光度(A)值,計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率:抑制率=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100%。

1.5 Tet對(duì)HPF細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響 采用免疫細(xì)胞化學(xué)法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 HPF細(xì)胞,1×105mL-1接種于預(yù)置蓋玻片的 6孔板,24 h后換液,對(duì)照組不加Tet,Tet組Tet終濃度分別為20、40、80和160μmol/L,培養(yǎng)48 h后0.01 mmol/L PBS沖洗3次,冷丙酮+無(wú)水乙醇(體積比1:1)固定。采用SP法,操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,鼠抗PCNA單克隆抗體稀釋度為1:50。胞核呈棕黃色為PCNA陽(yáng)性。200倍鏡下計(jì)數(shù) 100個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率,即PCNA陽(yáng)性表達(dá)率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0對(duì)HPF的生長(zhǎng)抑制率和PCNA陽(yáng)性表達(dá)率行單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HPF培養(yǎng)、鑒定結(jié)果 采用組織塊培養(yǎng)法原代接種 48 h后觀(guān)察到有細(xì)胞從組織塊周?chē)莱?組織片的邊緣可見(jiàn)“毛刷狀”緣,細(xì)胞呈火焰狀或放射狀延展,輪廓清晰,胞體透亮(圖1A)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)蓋玻片,固定風(fēng)干后行 HE染色,可見(jiàn)細(xì)胞輪廓清晰,呈扁平多邊狀的上皮形態(tài),胞質(zhì)內(nèi)為淡紅色,胞核邊界清晰,有的可見(jiàn)“雙核”(圖1B)。SP法染色鑒定細(xì)胞,見(jiàn)波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性,位于胞質(zhì),呈現(xiàn)與HPF長(zhǎng)軸方向一致棕黃色束狀或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖1C),細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)顯示為棕黃色、黃色或淺黃色細(xì)小均勻顆粒,分布于整個(gè)細(xì)胞核。

圖1 HPF細(xì)胞鑒定結(jié)果A:HPF原代細(xì)胞(×40);B:HPF傳代細(xì)胞(HE,×200);C:HPF波形蛋白染色(SP,×200)。

2.2 Tet作用后HPF的生長(zhǎng)抑制率 結(jié)果見(jiàn)表1。對(duì)照組細(xì)胞呈鋪路石樣、排列整齊貼壁生長(zhǎng);Tet組細(xì)胞變圓、分布松散,且細(xì)胞數(shù)減少。

表1 Tet作用后HPF的生長(zhǎng)抑制率 %

2.3 Tet對(duì)HPF細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響 結(jié)果見(jiàn)圖 2、表 2。

圖2 Tet組HPF細(xì)胞PCNA的表達(dá)(SP,×200)

表2 不同濃度Tet作用48 h對(duì)HPF PCNA表達(dá)的影響

3 討論

翼狀胬肉是眼科的常見(jiàn)病之一,病理學(xué)研究[1]表明,它的主要成分是異常增生的成纖維細(xì)胞和新生血管,具有類(lèi)似腫瘤發(fā)生前的性質(zhì)。纖維增生和新生血管化的范圍和程度是預(yù)測(cè)翼狀胬肉切除術(shù)后復(fù)發(fā)的可靠形態(tài)學(xué)指標(biāo)[2]。作者直接從人翼狀胬肉組織培養(yǎng)細(xì)胞,其生物學(xué)特性基本和人眼病變的翼狀胬肉情況相符合。進(jìn)一步采用免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)細(xì)胞鑒定,其波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性,角蛋白表達(dá)陰性。結(jié)合組織來(lái)源和細(xì)胞生長(zhǎng)特性可以確認(rèn)為HPF細(xì)胞。

Tet是從中藥防己、粉防己或千金藤中分離出來(lái)的一種生物堿,為雙芐基異喹衍生物,具有消炎、鎮(zhèn)痛、解熱、抗過(guò)敏、抗自由基及抗癌等多種藥理作用,還具有抑制成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成作用[3]。有研究[4]發(fā)現(xiàn),Tet在5μmol/L以上濃度能明顯抑制體外培養(yǎng)的人瘢痕 HPF細(xì)胞增殖和膠原合成, Tet的抗瘢痕作用可能通過(guò)直接抑制HPF細(xì)胞DNA合成、調(diào)控其膠原代謝以及對(duì)細(xì)胞因子的間接作用等方面來(lái)完成[5]。

作者采用不同濃度Tet干預(yù)人翼狀胬肉HPF細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),Tet可抑制人翼狀胬肉HPF細(xì)胞生長(zhǎng),隨著干預(yù)濃度的增大和時(shí)間延長(zhǎng),抑制率增加;而且降低PCNA陽(yáng)性表達(dá)率。PCNA是一種核內(nèi)蛋白,是DNA復(fù)制時(shí)D聚合酶的輔酶,直接參與核內(nèi)DNA的合成,主要表達(dá)在細(xì)胞增生周期的 S期,與細(xì)胞增殖活動(dòng)密切相關(guān),可作為一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便且直觀(guān)研究細(xì)胞增殖狀況的指標(biāo)[6]。作者發(fā)現(xiàn)當(dāng) Tet的濃度≥20μmol/L時(shí)能抑制細(xì)胞PCNA的表達(dá),這與采用MTT法檢測(cè)的Tet對(duì)細(xì)胞增殖活性具有抑制作用的結(jié)果相一致。該研究結(jié)果表明Tet能抑制HPF增生,提示 Tet對(duì)翼狀胬肉的治療具有潛在的應(yīng)用前景。總之,該研究為尋找翼狀胬肉新的輔助治療方法提供了一條思路,但目前研究?jī)H限于離體實(shí)驗(yàn),且Tet發(fā)揮作用機(jī)制較為復(fù)雜,有待進(jìn)一步研究。

[1]Coroneo MT,Di Girolamo N,Wakefield D.The pathogenes is of pterygia[J].Curr Opin Ophthalmol,1999,10(4):282

[2]Tan DT,Chee SP,Dear KB,et al.Effectof p terygium morphology on p terygium recurrence in a controlled trial comparing conjunctival autografting with bare sclear excision [J].Arch Ophthalmol,1997,115(10):1 235

[3]徐永紅,邊城,李定國(guó),等.漢防己甲素對(duì)成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的作用[J].天津醫(yī)藥,2004,32(10):633

[4]劉德伍,李國(guó)輝,劉德明,等.粉防己堿抑制瘢痕形成機(jī)理的研究[J].中藥藥理與臨床,2000,16(6):10

[5]劉德伍,李國(guó)輝,鄒萍,等.粉防己堿對(duì)PDGF、TGF2β誘導(dǎo)瘢痕成纖維細(xì)胞增殖與膠原合成的抑制作用[J].中藥藥理與臨床,2004,20(4):10

[6]Ohta Y,Ichimura K.Proliferation markers,proliferating cell nuclear antigen,Ki67,5-bromo-2'-deoxyuridine,and cyclin D 1 inmouse olfactory epithelium[J].Ann Otol Rhinol Laryngol,2000,109(11):1 046