RP-HPLC測定三種黃連中的生物堿含量

崔國輝,袁漢堯,周克元

(廣東醫(yī)學院檢驗學院臨檢教研室,廣東 湛江 524023)

黃連是毛茛科植物黃連(Coptis chinensis franch)的干燥根莖,文獻報道,它含有小檗堿、巴馬亭、藥根堿、黃連堿等多種原小檗堿型生物堿。祖國醫(yī)學記載其具有清熱、解毒的作用,很早就用于消化系統(tǒng)的治療和研究。例如魯勁松等[1]研究發(fā)現(xiàn)黃連總生物堿(TA)通過抑制胃炎時黏膜細胞的凋亡從而對幽門螺旋桿菌脂多糖(Helicobacterpylori,LPS)引起的大鼠胃部炎癥有保護作用。而黃連中的主要成分小檗堿可以誘導人結腸癌細胞株增殖抑制[2]。利用高效液相色譜可以將黃連中主要的生物堿成分進行分離,可以用于黃連的質量控制以及主要成分含量的測定[3-4],但也存在很多問題,諸如分離差、峰型對稱性差、色譜柱壽命短和試劑消耗大的問題。筆者參考有關文獻,利用反相高效液相色譜檢測黃連中生物堿含量,并對云南黃連、北美黃連以及四川黃連中三種生物堿的含量進行分析比較。同時對其加樣回收率、樣品穩(wěn)定性、精密度進行分析。

1 儀器和試藥

1.1 儀器和色譜條件 色譜柱為安捷倫 C18柱子(250 mm×4.6 mm,5μm);流動相為乙腈 -水(48∶52,每 1L含有磷酸二氫鉀 3.4 g,十二烷基硫酸鈉 1.7 g);流速為 1.0 ml/min;檢測波長為 345 nm;進樣量為 20μl。

1.2 試藥 云南黃連、四川黃連于成都藥材市場購買,北美黃連于哈佛大學康景軒教授提供,經由天然藥物中心鄧亦峰高級研究員鑒定。鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬亭、鹽酸藥根堿對照品由中國藥品生物制品鑒定所購買。水為三蒸水,乙腈為色譜純。甲醇、鹽酸為分析純。

1.3 對照品溶液的準備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品 6.00 mg,鹽酸巴馬亭對照品 1.65 mg,鹽酸藥根堿對照品 10.68 mg,分別以濃鹽酸 -甲醇(1∶99,V/V)定容于 10 ml容量瓶中,作為對照品溶液。

1.4 供試品溶液的制備 稱取黃連藥材分別粉碎至過 20目篩,稱取約 0.1 g,精密秤定,置于 100 ml容量瓶之中,加濃鹽酸 -甲醇(1∶99,V/V)約 95 ml,60℃水浴 15 min,超聲振蕩 30 min,靜置過夜,濃鹽酸 -甲醇(1∶99,V/V)定容至刻度,混勻,0.45 μm濾膜過濾,即得。按照上述色譜條件進行測定,以鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬亭、鹽酸藥根堿三種生物堿的對照品確定色譜峰的歸屬。

1.5 標準曲線以及線性范圍 依次分別準確量取鹽酸小檗堿對照品溶液 80μl、200μl、240 μl、280 μl、320 μl;鹽酸巴馬亭對照品 140 μl、200 μl、240 μl、280 μl、360 μl;鹽酸藥根堿對照品 12 μl、16 μl、24 μl、28 μl、36 μl,以濃鹽酸 -甲醇 (1∶99,V/V)定容至 2 ml容量瓶刻度。搖勻,精確吸取上述各溶液 20μl,按照上述色譜條件進行測定,以進樣濃度為橫坐標(X),3次測量得到的峰面積均值為縱坐標(Y),峰面積對應的進樣量濃度進行線性回歸計算,得到鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬亭、鹽酸藥根堿的回歸方程。

2 結 果

2.1 線性關系 繪制三種標準品的標準曲線。結果見表 1、表 2、表 3。

表1 藥根堿標準品峰面積大小-濃度表(n=3)

表2 巴馬亭標準品峰面積大小-濃度表(n=3)

表3 小檗堿標準品峰面積大小-濃度表(n=3)

2.2 樣品測定 取對照品溶液及不同編號的黃連藥材供試品溶液,在上述色譜條件下進樣,每次20μl,測定峰面積值,用峰面積按外標一點法計算含量,結果見圖 1、表 4、表 5。

圖1 RP-HPLC色譜圖1藥根堿(jatrorrhizine) 2巴馬亭(palmatine) 3小檗堿(berberine)A混合對照組 B云南黃連樣品 C北美黃連樣品 D四川黃連樣品

表4 三種黃連三種組分的峰面積測定值(n=3,mAUis)

表5 黃連藥材的含量測定結果(n=3,%)

2.3 加回收率試驗 分別取 3份已測知這三種生物堿含量的黃連藥材各約 50 mg,精密秤定,分別精密加入對照品溶液(含鹽酸小檗堿 2.8 mg、鹽酸巴馬亭 0.65 mg、鹽酸藥根堿 0.46 mg),按供試液制備和含量測定方法操作,結果該法測定黃連藥材中的小檗堿、巴馬亭、藥根堿的加回收率分別為103.8%(RSD為 1.8%,n=3)、103.8%(RSD為3.0%,n=3)、117.4%(RSD為 6.3%,n=3)。結果見表 6。

表6 加收率試驗結果比較

2.4 穩(wěn)定性試驗 小檗堿、巴馬亭、黃連堿及藥根堿等原小檗堿型生物堿的分子結構相似,化學性質亦相似,故選擇小檗堿考察方法學穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。取 0.096 mg/ml小檗堿溶液,分別于制備后的 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h進樣 ,每次 20 μl,分別測定峰面積,計算相對標準偏差(RSD)。結果表明供試品溶液在 10 h內穩(wěn)定,鹽酸小檗堿峰面積 RSD為 2.4%。結果見表 7。

表7 樣品穩(wěn)定性試驗結果

2.5 精密度試驗 精密吸取 0.06 mg/mL的鹽酸小檗堿對照品溶液,依法進樣測定 5次考察儀器精密度,每次 20μl,分別測定峰面積,計算 RSD為0.8%。結果見表 8。

表8 精密度試驗結果

3 討 論

3.1 流動相的選擇 黃連中原小檗堿型生物堿屬于季銨鹽,不易在 C18柱上保留。分離效果較好、峰型對稱性好,但是系統(tǒng)平衡時間長。如果不加入離子對試劑,原小檗堿型生物堿等的保留能力下降,分離效果差,峰型托尾。故選用乙腈 -水溶液(48∶52,每 1 L含磷酸二氫鉀 3.4 g,十二烷基硫酸鈉 1.7 g)作為流動相,峰型對稱性較好,與其他的雜質峰完全達到基線分離,取得了滿意的效果。

3.2 檢測波長的選擇 紫外光譜表明,鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬亭、鹽酸藥根堿的吸收曲線形狀相似,在 200-400 nm波長范圍有兩個最大吸收波長(265 nm和 345 nm),且在兩個波長處的響應值無明顯差別。從色譜圖看,以 265 nm為檢測波長,基線噪音較高,為 0.04 Mau,以 346 nm為檢測波長,基線噪音為 0.02 Mau,因此采用 345 nm為檢測波長。

3.3 進樣量的確定 在反相色譜中原小檗堿型生物堿保留弱,流動相中有機相比例應較低,而樣品試劑主要是甲醇,如果進樣量太大,會因為樣品在色譜柱中展寬而導致峰型變異。經過方法學試驗驗證,進樣 20μl可以滿足各項指標,并且峰型較好。

3.4 柱溫的影響 20℃以上測定效果較好,柱溫太低,流動相易析出絮狀物。

3.5 云南黃連、北美黃連、四川黃連三種黃連生物堿含量的差異沒有統(tǒng)計學意義,而云南黃連含量少,北美黃連需要進口,所以可以用國內應用比較廣泛的四川黃連在某些方面代替另外兩種黃連應用。黃連中主要生物堿藥理作用相似,但還是有差別,例如小檗堿對去甲腎上腺素致大鼠胃平滑肌舒張的作用并無明顯影響;但巴馬亭可增強去甲腎上腺素致大鼠胃平滑肌舒張的作用;而黃連總生物堿可顯著對抗去甲腎上腺素致大鼠胃平滑肌舒張的作用,提示小檗堿和巴馬亭對 α-受體的作用不顯著,而在黃連總生物堿中可能含有可拮抗 α-受體的成分[5]。至于黃連各個品種之間在藥理作用方面是不是有差別,以后的研究將進一步闡述。

本文建立了一種簡單快速的反相高效液相色譜方法,結果準確可靠,重現(xiàn)性好,可以用于黃連藥材中原小檗堿型生物堿的含量測定。

[1] 魯勁松,劉玉慶,李 明,等.黃連總生物堿對大鼠胃黏膜損傷的保護作用及其機制研究[J].中國中藥雜志,2007,32(13)∶1 333-1 336.

[2] 陸 寧,王邦茂,黃迫俠,等.黃連素對脫氧膽酸誘導的人結腸癌細胞株增殖抑制作用及機制[J].中華消化雜志,2006,26(9)∶632-633.

[3] 黃小平,李隆云,瞿顯有,等.石柱黃連指紋圖譜研究[J].中藥材,2006,29(7)∶666-669.

[4] 徐 穎,周世文,湯建林,等.高效液相色譜法測定黃連生藥中鹽酸小檗堿的含量[J].第三軍醫(yī)大學學報,2007,29(2)∶179-180.

[5] 譚正懷,李杭翼.小檗堿、巴馬亭及黃連總生物堿對大鼠胃條的作用比較研究[J].中藥藥理與臨床,2006,22(34)∶48-50.