參芪扶正注射液對輪狀病毒感染性腸炎小鼠血清 IL-2、INF-γ的影響

李文英,傅萬海,陳國新,梁 劍

(1.廣東省第二人民醫院兒科,廣東 廣州 510317;2.廣州市天河區中醫院兒科,廣東 廣州 510655)

人輪狀病毒(Human Rotavirus,HRV)感染引起兒童腹瀉常發生在秋冬季,發病率高,傳染性強,病情兇險,是發展中國家小兒死亡的主要疾病。目前全世界還未發現特效的治療藥物,僅限于補液和調節酸堿平衡,但效果皆不盡人意。中醫方面也有口服驗方治療該病的報導,但嬰幼兒存在口服中藥的困難,特別是伴有嘔吐和中重度脫水的患兒更難吸收。我們自 2002年以來,在臨床上靜脈使用參芪扶正注射液配合常規補液治療輪狀病毒感染性腹瀉取得了較顯著的療效。為了從理論角度明確參芪扶正注射液對輪狀病毒腸道感染后機體免疫功能的影響,我們在 2008年 11月至 2009年 8月間進行了相關動物實驗,以小鼠 HRV感染模型研究了參芪扶正注射液治療輪狀病毒感染時機體免疫功能的變化,現將結果報道如下:

1 材料與方法

1.1 實驗動物及病毒 BLAB/C健康小鼠 80只,由南方醫科大學實驗動物中心提供。將實驗小鼠隨機分為正常組、模型組、病毒唑組和參芪扶正注射液治療組,每組各 20只。實驗前所有小鼠大便RV抗原經膠體金法檢測呈陰性。HRV細胞懸液,由中國醫學科學院病毒研究所提供。

1.2 實驗藥物及試劑 參芪扶正注射液成份為黃芪、黨參,由麗珠集團利民制藥廠生產,每瓶 250 ml。病毒唑為廣東江門制藥廠產品,100 mg/ml(批號:000706)。糞便 HRV抗原檢測試劑盒由上海名碘生物工程公司提供;IL-2、IFN-γ檢測試劑盒由深圳晶美生物工程有限公司提供。

1.3 感染造模 除正常對照組外均按 Schoub[1]方法將滴度為 4.4×105pfu/只 0.1 ml HRV懸液經口感染小鼠。正常對照組給等量生理鹽水(NS)。病毒接種后,各組隔離飼養觀察。12 h后收集每只小鼠糞便。

1.4 判斷小鼠是否感染輪狀病毒 病毒接種后 1-4 d摩腹收集小鼠大便,放入 EP管于 -80℃保存備用,膠體金法檢測 RV抗原。

1.5 給藥方式 其中參芪扶正注射液治療組用極細小尼綸管經口滴入參芪扶正注射液 0.1 ml/(只?次),3次/d,連續給藥 7 d。病毒唑組用同樣方法滴入病毒唑,0.1 ml/(只?次),3次/d,正常組與模型組均滴入等量細胞培養液,連續 7 d。

1.6 臨床觀察及標本的留取 每天觀察記錄各組動物的臨床表現(大便性狀、小鼠的精神狀態、毛色、采食狀況和體重等)。在末次給藥后 24 h各組隨機抽取 12只小鼠,每只斷頸留血約 0.5 ml,放置于清潔的肝素鈉抗凝管內,搖勻,將血液以 4 000 r/min的速度離心 15 min,取血清,-20℃保存備用。同時解剖小鼠,留取肝臟、脾臟、腎臟及小腸,10%甲醛固定待檢。

1.7 檢測項目

1.7.1 組織病理學檢測 各臟器用 10%甲醛固定、脫水、包埋、切片和蘇木素 -伊紅染色后行病理學檢查。

1.7.2 IL-2、IFN-γ表達的測定 采用雙抗體夾心 ELISA法檢測小鼠血清中 IL-2、IFN-γ的表達,具體操作步驟嚴格按試劑盒說明進行。

1.8 統計學處理 各組數據以均數 ±標準差(x±s)表示,用 SPSS13.1軟件進行統計分析。全部數據經方差齊性分析后,采用單因素方差分析和 t檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 臨床表現 所有感染組小鼠在接毒后第 2天均出現明顯的腹瀉癥狀(大便軟、灘不成形,稀便或水樣便),第 3-4天癥狀達到高峰,后逐漸恢復,至第 7天癥狀有不同程度的消失。正常對照組保持正常情形,體毛平順,食欲正常,精神活躍,體重正常。

2.2 大便 RV抗原檢測 治療前除正常對照組以外所有小鼠大便 RV抗原檢測均呈強陽性。在治療第 4天,檢測各組糞便 RV情況,模型組均陽性(20/20),病毒唑組陽性 11只(11/20),參芪組陽性2只(2/20),正常對照組均陰性(0/20),經統計學處理,參芪組陽性率明顯低于模型組,差異有統計學意義(P＜0.05);且低于病毒唑組,差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.3 組織病理學改變 感染組可見小腸上皮變性脫落,腸絨毛變平,萎縮,腎小體和腎小管上皮輕度空泡變性,其他組織器官未見明顯改變。正常對照組各器官未見明顯改變。

2.4 血清中 IL-2、IFN-γ的表達情況 參芪治療組血清 IL-2含量顯著高于模型組,差異有統計學意義(P＜0.05);與正常對照組比較差異則無統計學意義(P＞0.05)。參芪治療組 INF-γ表達含量高于模型組及正常對照組,差異有統計學意義(P＜0.05),但與病毒唑組比較差異則無統計學意義。見表 1。

表1 參芪扶正注射液對 HRV感染小鼠IL-2、INF-γ表達的影響(x±s)

3 討 論

參芪扶正注射液是采用我國傳統補氣藥物黨參、黃芪為主要原料精制而成的純中藥制劑,具有扶正固本、補脾益氣之功效。參芪并用具有較好的扶正功效及免疫調節作用[2]。

許多研究發現細胞因子在 RV感染引起的腸道內、外感染發病中起重要作用,在 RV感染早期,細胞免疫應答以 Th1反應為特征,Th1應答優勢往往引起感染的痊愈[3],以介導細胞免疫應答為主的 Th1細胞主要分泌 IL-2、IFN-γ等細胞因子,其中 IL-2主要由活化的淋巴細胞產生,是調節機體免疫功能最主要的淋巴因子之一[4]。IL-2能激活多種免疫細胞,誘導淋巴細胞的增生與免疫效應,促進 B細胞的免疫應答以及 NK細胞、單核巨噬細胞的增生[5]。INF-γ是活化的 T淋巴細胞產生的一種具有多潛能的細胞因子,對免疫系統具有重要的調節作用,它不僅能激活巨噬細胞,還能活化 NK細胞,而 NK細胞是構成免疫防御第一道防線的非特異性殺傷細胞,因此 IFN-γ的釋放在 RV感染的急性期起保護性作用[6]。

從本研究的實驗結果我們可以認為參芪扶正注射液能夠改善輪狀病毒感染小鼠的腹瀉癥狀,該作用可能通過兩個方面的藥理作用完成,一方面參芪扶正注射液抑制輪狀病毒在小鼠體內的復制從而減少病毒感染導致的腹瀉;另一方面經參芪扶正注射液治療后小鼠血清 IL-2和 INF-γ含量有顯著增高,表明參芪扶正注射液可以增強輪狀病毒感染小鼠的免疫功能,可能是由促進小鼠 Th1細胞活化所致,當然其具體機制尚待進一步研究。

綜上所述,參芪扶正注射液在抑制輪狀病毒復制的同時能提高機體細胞免疫功能,使病毒感染所致的細胞免疫水平下降及細胞免疫功能損傷得到較快的恢復,因此臨床上可應用于輪狀病毒感染且免疫功能低下患兒的治療。

[1] Schoub BD,Progesky DW.Antiviral Activity of Ribavirin in Rotavirus Gastroemteritis of Mice,Antimicr[J].Agen and Chemotr,1997,12∶543.

[2] 耿維鳳,陳 敏.參芪扶正注射液臨床初步觀察[J].中國醫院藥學雜志,2003,23(9)∶554.

[3] 徐 錦,楊 毅,孫家娥,等.急性輪狀病毒性腹瀉患兒免疫應答的觀察[J].中華微生物學和免疫學雜志,2006,26(3)∶248-251.

[4] Azevedo M,Yuan L,Pouly S,et al.Cytokine responses in gnotobiotic pigs after infection with virulent or attenuated human rotavirus[J].Jvirology,2006,80(1)∶372-382.

[5] Kim JW,Ferris RL,Whiteside TL.Chemokine C Receptor Expression and Protection of Circulating CD8+T Lymphocytes from Apoptosis[J].Clin Cancer Res,2005,11(21)∶7 901-7 910.

[6] Sugata K,Taniguchi K,Yui A,et al.Analysis of rotavirus antigenemia and extra-intestinal manifestations in children with rotavirus gastroenteritis[J].Pediatrics,2008,122(2)∶392-397.