p53及耐藥相關(guān)基因的表達與非小細胞肺癌化療耐藥性的研究

孫 超,時會云,袁東朋

(東?？h人民醫(yī)院胸外科,江蘇 東海 222300)

化療是肺癌非手術(shù)治療的一線選擇,研究證實以順鉑為基礎的聯(lián)合化療是治療進展期非小細胞肺癌(NSCLC)的基本方案,但有效率亦僅 25%-30%,化療反應率低與腫瘤細胞對聯(lián)合化療產(chǎn)生原發(fā)或繼發(fā)性耐藥有關(guān)[1]。隨著對腫瘤發(fā)生及聯(lián)合化療分子機制的認識,已證實一些腫瘤分子標志的改變與化療敏感性有關(guān),如:P-糖蛋白 (P-glycoprotein,P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白 (Multidrug resis-tance-associated protein,MRP)、肺耐藥相關(guān)蛋白(Lung resistance-associated protein,LRP)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(Glutathione-S-transferase-pi,GST-π)等多種耐藥相關(guān)的酶和蛋白。近年來研究發(fā)現(xiàn)p53基因異常也在腫瘤細胞耐藥性的產(chǎn)生中扮演了重要角色[2]。p53基因是影響細胞周期阻滯和凋亡過程的重要分子事件,細胞周期和凋亡異常又與腫瘤耐藥密切相關(guān)。本研究旨在總結(jié)突變型 p53蛋白和 4種耐藥相關(guān)蛋白的表達情況,以明確肺癌細胞中 p53突變與化療耐藥性產(chǎn)生的相關(guān)性,了解其表達的一般規(guī)律和特點,為臨床個體化選用合理的化療藥物提供客觀的實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料來源 60例 NSCLC組織均取自2003年 5月至 2009年 10月在我院經(jīng)纖維氣管鏡活檢或手術(shù)切除肺癌組織?；顧z前均未行全身及局部化療和放療,活檢后均根據(jù)不同的病理類型給予化療。其中男 39例,女 21例;年齡 30-71歲,平均 53歲。其中鱗癌 41例,腺癌 19例。分化程度:高分化20例,中分化 23例,低分化 17例。TNM分期:Ⅰ -Ⅱb期 9例,Ⅲ a期 12例,Ⅲ b期 13例,Ⅳ期 26例。根據(jù)胸部 CT檢查,有縱隔淋巴結(jié)腫大者 27例,無腫大者 33例。所有患者術(shù)后或活檢后均接受至少兩個周期的化療,化療結(jié)束后 5-7 d拍胸片,觀察化療效果并評定療效。療效根據(jù) WHO標準確定,達完全緩解或部分緩解者為療效有效,穩(wěn)定或進展者為療效無效。取患者健側(cè)相應部位的支氣管黏膜為對照。

1.2 免疫組織化學染色及結(jié)果判定 鼠抗人P-gp、MRP、LRP、GST-π、突變型 p53單克隆抗體及 SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑試劑盒,均購于北京中杉生物技術(shù)開發(fā)公司。免疫組化染色:標本均經(jīng) 10%中性甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,4μm連續(xù)切片,50℃恒溫箱中固定脫水 24 h,梯度二甲苯脫蠟水化,其余步驟按照 SP免疫組化試劑盒說明書進行,DAB顯色,蘇木素復染,中性樹膠固封。使用已知陽性片作為陽性對照,用 PBS代替一抗作為陰性對照。P-gp表達位于細胞膜,MRP、LRP、GST-π表達均位于細胞膜和∕或細胞漿,p53表達位于細胞核,陽性反應為棕黃色顆粒;每張切片在高倍鏡下(×400)隨機計數(shù) 10個視野,計算其陽性率。判斷標準:整張切片均無著色或偶有淺黃色細胞但陽性細胞數(shù) ＜5%為陰性(-),10%-25%為陽性(+),25%-75%為(++),＞75%為(+++);耐藥基因相關(guān)蛋白陽性表示腫瘤對該耐藥基因所介導的藥物具有耐受性。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用 SPSS 13.0軟件進行卡方檢驗分析相關(guān)數(shù)據(jù),P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺癌組織各基因的表達情況 P-gp在癌細胞的細胞膜呈彌漫性表達,MRP、LRP、GST-π在肺癌組織的細胞膜和∕或細胞漿呈彌漫性或灶性分布,p53則在細胞核呈陽性表達。具體結(jié)果見表1。

表1顯示:(1)60例 NSCLC中 P-gp陽性表達32例(53.3%),MRP陽 性 表 達 30例(50.0%),LRP陽性表達 45例(75.0%),GST-π陽性表達 44例 (73.3%),p53陽性表達 41例 (68.3%)。(2)LRP在腺癌中表達最高,p53在鱗癌中表達最高,P-gp、MRP1和 GST-π在腺癌與鱗癌中表達率相差不大。x2檢驗分析表明,P-gp的表達為腺癌 ＞鱗癌,但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);MRP的表達為鱗癌 ＞腺癌,但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);GST-π的表達腺癌和鱗癌相當,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);LRP的表達為腺癌 ＞鱗癌,且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);p53的表達為鱗癌 ＞腺癌,差異亦有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。(3)突變型 p53的表達與腫瘤細胞分化程度相關(guān),其表達隨著腫瘤分化程度的升高而呈遞減趨勢,高分化組 p53的表達明顯低于中、低分化組(P＜0.05)。其余 4種耐藥相關(guān)蛋白的表達與腫瘤的分化程度無顯著相關(guān)性(P＞0.05)。(4)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者p53表達水平明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),且 p53表達與腫瘤 TNM分期相關(guān),肺癌從Ⅰ期到Ⅳ期,其表達逐漸升高。其余 4種蛋白在不同 TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中表達差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表1 P-gp、MRP、LRP、GST-π和 p 53蛋白在 NSCLC中的表達[例(%)]

2.2 p53及耐藥相關(guān)蛋白的共表達現(xiàn)象 60例中有 p53和一種或一種以上耐藥相關(guān)蛋白表達陽性,表達率達 94.8%,其中 21例 4種耐藥相關(guān)蛋白表達均為陽性,表達率達 35.0%。p53與 P-gp、GST-π間的表達有相關(guān)性,Spearman等級相關(guān)分析也顯示 p53與 P-gp、GST-π的表達呈正相關(guān)(P＜0.05),表達率分別為 71.2%和 51.7%。p53與LRP、MRP的表達無明顯相關(guān)性(P＞0.05),見表 2。

表2 p53蛋白與各耐藥相關(guān)蛋白表達的相關(guān)性

2.3 p53及耐藥相關(guān)蛋白的表達與 NSCLC臨床化療療效的關(guān)系 患者均接受含鉑化療方案,以EP、MVP、NP方案為主,總有效率為 56.67%(34/60),本研究中 60例患者均有完整隨訪資料,生存期計算自化療或手術(shù)首日始至死亡或失訪日止。中位隨訪時間為 35個月,其中 39例死亡。p53蛋白的表達與化療療效顯著相關(guān),p53陰性化療有效率為60.5%,p53陽性化療有效率只有 28.3%(P＜0.05)。部分患者雖然 p53蛋白表達陰性,但化療效果不明顯,分析原因為這部分患者有 P-gp、MRP、LRP、GST-π基因一種或多種共表達,致其對含鉑方案不敏感。p53陽性表達者不同化療方案有效率分別為 EP 22%,MVP 27%,NP 33%,x2檢驗顯示,與不同化療方案之間 p53蛋白的表達無顯著相關(guān)(P均 ＞0.05)。

3 討 論

腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性是目前抗腫瘤化療失敗的主要原因之一。產(chǎn)生耐藥性的腫瘤細胞不僅對使用過的抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥,而且對多種未曾用藥物治療的腫瘤和作用機理不同的藥物也產(chǎn)生耐藥,這種現(xiàn)象稱為多藥耐藥性(Multi drug resistance,MDR)。事實上,腫瘤化療的耐藥性常常是多種耐藥蛋白參與及不同機制共同作用的結(jié)果。多藥耐藥基因是一個大家族,研究比較肯定的有 P-gp、MRP、LRP、GST-π、Topo-Ⅱ等,其中 P-gp被認為是介導腫瘤多藥耐藥的最主要機制[1-2]。有研究認為,MDR基因的過度表達除了腫瘤進展過程中腫瘤細胞自身產(chǎn)生外,還與體內(nèi)有害物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的長期刺激、化療藥物誘導以及多種基因調(diào)節(jié)效應有關(guān)[3]。最近研究表明,許多臨床常用的腫瘤化療藥物均能誘導腫瘤細胞凋亡,凋亡可能是多數(shù)化療藥物細胞毒作用的最終共同途徑,而參與凋亡過程調(diào)控的 p53、Bcl-2等基因的表達失控可能導致腫瘤細胞對多種化療藥物耐受[4]。隨著肺癌 MDR研究的擴展和深入,人們越來越多地關(guān)注到細胞凋亡相關(guān)基因在 MDR中的作用。

野生型 p53基因作為一種抑癌基因,在細胞周期的調(diào)控和誘導凋亡中起重要作用,Chin等[5]認為,突變后的 p53可能會激活 MDR-1基因的啟動因子,誘導 MDR-1基因的復制,使腫瘤細胞對化療的敏感性大大降低。本研究中,p53與 P-gp、GST-π的表達存在明顯相關(guān)性。p53蛋白的積聚作為NSCLC患者化療的負相關(guān)性預后指標,提示腫瘤細胞中 p53蛋白的狀態(tài)同樣是對化療反應一個頗為重要的因素。

本研究結(jié)果顯示,60例 NSCLC中 P-gp陽性表達 32例(53.3%),MRP陽 性 表 達 30例(50.0%),LRP陽性表達 45例(75.0%),GST-π陽性表達 44例 (73.3%),p53陽性表達 41例 (68.3%),提示p53及 4種耐藥相關(guān)蛋白中肺癌組織中高表達導致腫瘤組織的耐藥,這與有關(guān)報道相符[6]。同時 LRP和 P-gp在腺癌中表達要高于鱗癌,臨床上鱗癌比腺癌對化療敏感,而腺癌對化療存在普遍耐藥性亦與本結(jié)果相符;MRP和 GST-π的表達在腺癌和鱗癌無明顯差異 (P＞0.05)。p53在鱗癌中表達顯著高于腺癌,差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);且 p53的表達與腫瘤細胞分化程度及 TNM分期相關(guān),其表達隨著腫瘤分化程度的升高而呈遞減趨勢,肺癌從Ⅰ期到Ⅳ期,其表達也是逐漸升高的。

60例中有p53和一種或一種以上耐藥相關(guān)蛋白共表達率達 94.8%,其中 21例 4種耐藥相關(guān)蛋白表達均為陽性,共表達率達 35.0%?；颊呋熞?EP、MVP、NP方案為主,總有效率為 56.67%,p53蛋白的表達與化療療效顯著相關(guān),p53陰性者化療有效率(60.5%)明顯高于 p53陽性者(28.3%)。部分患者雖然 p53蛋白表達陰性,但化療效果不理想,分析其原因可能為這部分患者有 P-gp、MRP、LRP、GST-π基因一種或多種共表達,致其對含鉑方案不敏感。這表明 P-gp、MRP、LRP、GST-π不同程度地同時參與了腫瘤的耐藥形成,表達上的差異性與不一致性也正說明了影響腫瘤耐藥機制的多因素性。因此,聯(lián)合檢測腫瘤多個耐藥相關(guān)標志,同時評估多個耐藥基因的表達,能更加客觀地反映腫瘤的耐藥情況。臨床上可依據(jù)耐藥機制的不同,篩選出產(chǎn)生耐藥可能性最小的聯(lián)合化療方案,優(yōu)化組合,增強療效。

目前臨床醫(yī)師制定化療方案一般根據(jù)經(jīng)驗用藥或參考教科書,具有盲目性和不科學性。從本研究結(jié)果可看出,耐藥基因在不同個體中表達有很大差異,結(jié)合耐藥基因蛋白的作用機制與化療藥物的作用特點,針對個人選擇敏感的化療藥物是十分必要的。例如,順鉑是現(xiàn)今臨床上肺癌化療方案中必不可少的一線藥物,但不同肺癌患者 P-gp、MRP、LRP、GST-π等的表達卻不盡相同,如果按部就班使用傳統(tǒng)的化療方案,結(jié)果將不能高效地殺死腫瘤細胞,同時這也解釋了臨床上同一方案化療效果的不一致性。因此化療前綜合檢測患者腫瘤組織的p53及耐藥相關(guān)蛋白表達情況意義更大[7]:一方面,揭示腫瘤耐藥、復發(fā)的分子機制,估計化療效果和判斷預后;另一方面,依據(jù)其固有耐藥機制來指導化療,制定有效的個體化療方案;再者,可依據(jù)耐藥機制的不同,應用逆轉(zhuǎn)劑增強化療療效,提高非小細胞肺癌患者的有效生存期。野生型 p53基因替代治療并聯(lián)合化療可能是增強肺癌化療療效的有希望途徑。多種化療藥物敏感實驗、p53基因突變及多種耐藥基因表達的檢測,對于化療效果的預測、個體化化療方案的制定具有重要的意義。

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