β-葡萄糖苷酶以及益生菌生物轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷的研究進(jìn)展

韓 婷，程 鋼，劉 瑩，黃 文,*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430074)

β-葡萄糖苷酶以及益生菌生物轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷的研究進(jìn)展

韓 婷1，程 鋼2，劉 瑩1，黃 文1,*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430074)

大豆及其加工制品中以糖苷形式存在的大豆異黃酮不利于人體的消化吸收，難以發(fā)揮其生物保健作用。本文綜述了利用β-葡萄糖苷酶生物轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷以提高生物利用率的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展情況，重點(diǎn)介紹了外源性β-葡萄糖苷酶和產(chǎn)β-葡萄糖苷酶益生菌對(duì)大豆異黃酮糖苷的轉(zhuǎn)化作用。

大豆異黃酮；β-葡萄糖苷酶；水解；益生菌

大豆及其加工制品是人類(lèi)健康食譜中不可或缺的組成部分，近年來(lái)，大豆中的主要活性物質(zhì)大豆異黃酮由于具備多種生物活性，受了到國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的普遍關(guān)注。大豆異黃酮是大豆等豆科植物在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，在干大豆中的含量為0.5～0.7mg/g[1]，其結(jié)構(gòu)與雌激素相似，攝入體內(nèi)后能與雌激素受體結(jié)合，調(diào)節(jié)人體內(nèi)雌激素水平。西方國(guó)家居民的異黃酮每日平均攝入量較低，少于1mg/d，而亞洲國(guó)家居民的大豆異黃酮每日平均攝入量相對(duì)較高，大約為50～70mg/d[2]。研究發(fā)現(xiàn)，攝入足夠量的大豆異黃酮可以有效降低患骨質(zhì)疏松癥、婦女更年期綜合癥、高膽固醇癥、以及心血管疾病和癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[3]。

大豆中天然存在的異黃酮主要成分有3類(lèi)，即染料木素(genistein)類(lèi)、大豆苷元(daidzein)類(lèi)和黃豆黃素(glycitein)類(lèi)，各自又主要以4種形式存在：丙二酰基葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型、β-葡萄糖苷型和糖苷配基型(苷元)[4]，大豆異黃酮的化學(xué)成分組成見(jiàn)表1，其中結(jié)合型的糖苷占到了總異黃酮含量的80%～95%[5]。研究發(fā)現(xiàn)，糖苷形式的大豆異黃酮不能直接被小腸壁吸收，必須經(jīng)水解去除糖基轉(zhuǎn)化為游離型的苷元才可被小腸吸收[6]，水解過(guò)程如圖1所示，因而發(fā)揮生物活性的主體是游離型的苷元。如何有效的將糖苷型的大豆異黃酮通過(guò)水解轉(zhuǎn)化成游離型的苷元以增強(qiáng)大豆異黃酮的生物活性已成為近年來(lái)世界各國(guó)科學(xué)家研究的熱點(diǎn)。

常用的糖苷水解方法主要有酸解法和酶解法。由于酸水解存在一定的不安全因素，而酶水解反應(yīng)條件溫和，因而具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。水解大豆異黃酮糖苷的酶有β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶和α-半乳糖苷酶等[7]。目前，國(guó)內(nèi)外研究最多的是β-葡萄糖苷酶。本文就利用β-葡萄糖苷酶生物轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展情況進(jìn)行綜述。

表1 大豆異黃酮的分類(lèi)Table 1 The classification of soybean isoflavones

圖1 大豆異黃酮糖苷的水解Fig.1 Hydrolysis of soybean isoflavone glycosides

1 β-葡萄糖苷酶簡(jiǎn)介

β-葡萄糖苷酶屬于纖維素酶類(lèi)，于1 8 3 7年被Liebig和Wohler首次在苦杏仁中發(fā)現(xiàn)，后來(lái)發(fā)現(xiàn)該酶在自然界分布廣泛，普遍存在于植物、動(dòng)物和微生物中。β-葡萄糖苷酶的特性是可水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時(shí)釋放出β-葡萄糖和相應(yīng)的配基。因此，β-葡萄糖苷酶在制備大豆異黃酮活性苷元方面顯示出極大的應(yīng)用前景。

大豆自身含有內(nèi)源性的β-葡萄糖苷酶，Hsieh[8]和Suzuki等[9]分別從大豆和大豆幼苗根中對(duì)β-葡萄糖苷酶進(jìn)行了提取純化，并用于共軛型異黃酮結(jié)合物的水解，但水解活性不強(qiáng)，水解效率只有22%～29%。目前獲得β-葡萄糖苷酶的方法主要是從其他植物中提取和微生物液體發(fā)酵，杏仁是β-葡萄糖苷酶的最經(jīng)典的來(lái)源。但是植物來(lái)源的β-葡萄糖苷酶的活性遠(yuǎn)比微生物來(lái)源的活性低[10]。對(duì)微生物中的β-葡萄糖苷酶的研究主要集中在酵母、曲霉、木霉以及細(xì)菌內(nèi)，其中，曲霉被普遍認(rèn)為是產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的優(yōu)良菌種，尤以黑曲霉的效率最高[11]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌[4]和乳酸桿菌[12]具有產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力，在發(fā)酵豆奶的過(guò)程中可以將大豆異黃酮轉(zhuǎn)化成活性苷元，受到國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者的關(guān)注。

從微生物發(fā)酵液中提取β-葡萄糖苷酶，一般采用先經(jīng)硫酸銨、乙醇或丙酮沉淀等進(jìn)行初步分離，再經(jīng)離子交換柱層析、凝膠過(guò)濾柱層析、等電聚焦等進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化的方法[13-16]。

國(guó)內(nèi)外檢測(cè)β-葡萄糖苷酶活力通常以ρ-NPG(對(duì)硝基苯酚-β-D-吡喃葡萄糖苷)作為底物，在β-葡萄糖苷酶作用下ρ-NPG糖苷鍵斷裂生成ρ-硝基酚，反應(yīng)生成的ρ-硝基酚的總量可以在400～420nm波長(zhǎng)處通過(guò)紫外分光光度法檢測(cè)，吸光度越高，就說(shuō)明酶活越強(qiáng)[17-19]。

2 外源性β-葡萄糖苷酶對(duì)大豆異黃酮糖苷的轉(zhuǎn)化

目前，利用外源性β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷的研究仍處于實(shí)驗(yàn)階段，還沒(méi)有進(jìn)行工業(yè)化。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者研究了直接利用外源性β-葡萄糖苷酶對(duì)大豆異黃酮糖苷的水解作用。

徐茂軍[20]以豆奶和豆奶粉為實(shí)驗(yàn)材料，研究了不同濃度的商業(yè)β-葡萄糖苷酶對(duì)大豆異黃酮糖苷的生物轉(zhuǎn)化作用。結(jié)果表明，在β-葡萄糖苷酶濃度1.5U/mL、pH5.5、45℃保溫1h的條件下，能夠?qū)⒍鼓碳岸鼓谭壑猩镉行暂^低的染料木苷、乙酰染料木苷、丙二酰染料木苷等異黃酮糖苷化合物轉(zhuǎn)化為大豆苷元等相應(yīng)的異黃酮糖苷配基化合物，轉(zhuǎn)化率分別為91.6%、97.7%和94.1%。且利用β-葡萄糖苷酶可以在不影響產(chǎn)品色澤、口味等感官品質(zhì)的情況下，提高豆奶及豆奶粉中異黃酮的生物有效性。

汪海波等[21]以低純度的商品大豆異黃酮為原料，研究了采用β-葡萄糖苷酶制備大豆異黃酮苷元的最佳工藝參數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在酶的使用量為1.575U/10mg總黃酮、酶水解反應(yīng)時(shí)間2h、體系pH5、異黃酮底物質(zhì)量濃度400～600μg/mL、反應(yīng)溫度50℃的水解條件下可達(dá)到理想的水解效果。

Otieno等[22]對(duì)比了外源性β-葡萄糖苷酶(杏仁中提取)和產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株(雙歧桿菌和乳酸菌菌屬)對(duì)豆奶中大豆異黃酮糖苷的轉(zhuǎn)化作用。在37℃發(fā)酵開(kāi)始4h后，3個(gè)不同濃度(0.288、O.359、0.575U/mL)的外源性酶分別使總苷元濃度增加了5.87、5.92、5.77倍，而B(niǎo)ifidobacterium animalis ssp.lactis Bb12、Lactobacillus casei 2607、Lactobacillus acidophilus ATCC 4461分別使總苷元濃度增加了3.43、2.72、3.04倍，說(shuō)明外源性β-葡萄糖苷酶的水解效果較好，且在外源性β-葡萄糖苷酶作用下苷元濃度達(dá)到最大值所需的時(shí)間約為2h，而雙歧桿菌和乳酸桿菌則至少需要15h。

可見(jiàn)，直接利用外源性β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷，具有轉(zhuǎn)化率高、耗時(shí)短、反應(yīng)體系簡(jiǎn)單、條件溫和等優(yōu)點(diǎn)。但是，由于商業(yè)β-葡萄糖苷酶價(jià)格昂貴，而且不能回收利用，直接用于大豆異黃酮糖苷的生物轉(zhuǎn)化成本高，在應(yīng)用過(guò)程中受到很大限制。

采用固定化酶技術(shù)將β-葡萄糖苷酶固定在載體上

反復(fù)使用可以達(dá)到降低成本的目的。潘利華等[23]研究了以海藻酸鈉為載體，戊二醛為交聯(lián)劑固定化β-葡萄糖苷酶的條件及其在制備染料木素中的應(yīng)用，該固定化酶重復(fù)使用6次后其活力可以保持在90.94%，但染料木苷的轉(zhuǎn)化率為僅為60.02%。吳定等[24]用中空球形殼聚糖固定化β-葡萄糖苷酶，固定化后的β-葡萄糖苷酶活力降低了12.1%，再用固定化后的β-葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷，經(jīng)超濾、固定化酵母細(xì)胞等處理，可制備純度達(dá)94%的大豆異黃酮苷元，但是該方法操作較為復(fù)雜，也不易工業(yè)化。

因此，外源性β-葡萄糖苷酶對(duì)大豆異黃酮糖苷的生物轉(zhuǎn)化存在著諸多弊端，在應(yīng)用中受到很大限制，不利于工業(yè)化，目前，世界上不少研究者已經(jīng)將目光轉(zhuǎn)向了利用產(chǎn)β-葡萄糖苷酶益生菌菌株發(fā)酵豆奶轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷的研究。

3 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶益生菌菌株的篩選

圖2 大豆苷元的降解Fig.2 Degradation of daidzein

腸道細(xì)菌尤其是益生菌在異黃酮的代謝中起到了關(guān)鍵的作用[25]，部分益生菌還可以將大豆苷元進(jìn)一步代謝為雌馬酚(圖2)，與苷元相比它與雌激素受體的結(jié)合力更強(qiáng)[26]。然而，人體內(nèi)的益生菌的種類(lèi)和數(shù)量因人而異，并且受到年齡、疾病、膳食等因素的影響，這就導(dǎo)致并不是每個(gè)個(gè)體都可以將攝入體內(nèi)的大豆異黃酮類(lèi)化合物較好的吸收。與其他可以分泌β-葡萄糖苷酶的微生物如酵母、曲霉、木霉等相比，益生菌可以直接添加到大豆發(fā)酵產(chǎn)品中，在發(fā)酵過(guò)程中釋放出β-葡萄糖苷酶水解異黃酮糖苷為活性苷元形式使小腸吸收，促進(jìn)異黃酮生物功能的發(fā)揮。因此，研究益生菌對(duì)大豆異黃酮的降解機(jī)制，篩選高效的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶益生菌菌株，不僅可以提高大豆異黃酮在人體內(nèi)的吸收率，充分發(fā)揮大豆異黃酮的生物保健作用，還可以促進(jìn)腸道內(nèi)有益菌群的生長(zhǎng)，有益人體健康。

3.1 雙歧桿菌屬

雙歧桿菌屬是腸道菌群中的主要益生菌菌群之一，目前報(bào)道的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力較強(qiáng)的雙歧桿菌有：Bifidobacteriu long um、B.bifidum、B.adolescentis、B.breve、B.infantis、B.lactis、 B.pseudocatenulatum、B.animalis、B.longum、B.pseudolongum、B.thermophilum[4,19,22,27]等。

Raimondi等[27]研究了雙歧桿菌屬8個(gè)不同菌種下的22個(gè)菌株在含大豆苷(20mg/L)的MRS培養(yǎng)基內(nèi)對(duì)大豆苷的生物轉(zhuǎn)化作用，發(fā)現(xiàn)在7d的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，除B.longum MB220和B.longum MB224以外，其他菌株均可以水解大豆苷，其中 B.adolescentis MB116在生長(zhǎng)穩(wěn)定期早期表現(xiàn)了最高的酶活，為0.92U/mg。Tsangalis等[4]對(duì)雙歧桿菌屬B. pseudolongum、B. longum-a、B. longum-b、B. animalis和B. infantis 5個(gè)菌種在不同培養(yǎng)基中的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力進(jìn)行了比較，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)B.longum-b在MRS-glu中培養(yǎng)24h時(shí)呈現(xiàn)了最高的酶活(4.625U/mg)。但該菌種對(duì)培養(yǎng)基的要求很高，在其他培養(yǎng)基如MRS-lac、MRS-raf中不能產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，在豆奶中生長(zhǎng)48h后，產(chǎn)β-葡萄糖苷酶量仍然很少，對(duì)大豆異黃酮糖苷的轉(zhuǎn)化率較低，且該菌種不能將大豆苷元代謝為雌馬酚。最近，Avila等[28]報(bào)道了雙歧桿菌中產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力較強(qiáng)的菌株B.lactis BB-12，該菌株在MRS培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)18h后酶活高達(dá)20.10U/mg。

雙歧桿菌菌株水解大豆異黃酮糖苷的能力是普遍存在的，其產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力因菌株而異，表現(xiàn)出一定的種間差異性。Otieno等[7]對(duì)雙歧桿菌等發(fā)酵豆奶后在儲(chǔ)藏期內(nèi)不同溫度下β-葡萄糖苷酶的酶活穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。但是對(duì)于該菌屬產(chǎn)酶的生化表征尚未見(jiàn)報(bào)道，有待進(jìn)一步研究。

3.2 乳酸桿菌屬

乳酸桿菌屬是另外一類(lèi)主要的益生菌，同時(shí)與雙歧桿菌一樣，也是公認(rèn)的具產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力的菌群。目前報(bào)道的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力較強(qiáng)的乳酸桿菌有：Lactobacillus paraca sei subsp.paraca sei、L.gasseri、L.acidophilus、L.casei、L.rhamnosus、L.reuteri、L.plantarum、L.delbrueckii[29-32]等。

Marazza等[32]從乳酸桿菌屬下63個(gè)菌株中篩選出了產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的L.rhamnosus CRL981，該菌株在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h后，檢測(cè)到β-葡萄糖苷酶的酶活為22.93U/mg。該菌株在豆奶培養(yǎng)基中生長(zhǎng)12h后，能夠?qū)⒍鼓讨械拇蠖巩慄S酮糖苷基本水解完全。由此說(shuō)明該菌株不論是在MRS培養(yǎng)基中還是在豆奶培養(yǎng)基中的，生長(zhǎng)代謝速度都很快，對(duì)培養(yǎng)基種類(lèi)的依賴性較小。該作者同時(shí)對(duì)該菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的最佳條件和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該菌株產(chǎn)酶的最佳pH值為6.4，最適溫度為42℃，在4℃和－20℃條件下儲(chǔ)藏25d后，仍然可以保留72%的酶活。

L.rhamnosus CRL981產(chǎn)酶能力強(qiáng)，生長(zhǎng)代謝速度快，對(duì)培養(yǎng)基的依賴性小，且在較低溫度(4℃和－20℃)下保持了較好的酶活穩(wěn)定性，將其用于發(fā)酵豆奶生物轉(zhuǎn)

化大豆異黃酮糖苷可以大大提高產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，有著很好的應(yīng)用前景。

雙歧桿菌和乳酸桿菌屬菌株產(chǎn)酶能力大小往往與菌種、培養(yǎng)基種類(lèi)、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵時(shí)間等相關(guān)。Donkor等[33]比較了L.acidophilus L10、B.lactis B94和L.casei L26在37℃發(fā)酵豆奶48h的產(chǎn)酶能力，發(fā)現(xiàn)3個(gè)菌株的產(chǎn)酶能力大小順序?yàn)長(zhǎng).acidophilus L10＞B.lactis B94＞L.casei L26，這與Otieno等[31]得到的結(jié)論一致。Pyo等[34]研究了37℃條件下L.plantarum 00144、L.delbrueckii 01181、B.breve K-101和B.thermophilum 00748在豆奶培養(yǎng)基中48h內(nèi)的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)24h后，乳酸桿菌L.plantarum 00144和L.delbrueckii 01181進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，此時(shí)酶活最高，而雙歧桿菌B.breve K-101和B.thermophilum 00748生長(zhǎng)相對(duì)滯后，且24h時(shí)未達(dá)到最高酶活。在豆奶培養(yǎng)基中，雙歧桿菌生長(zhǎng)速率低于乳酸桿菌的原因是前者以豆奶中的α-半乳糖基低聚糖(包括水蘇糖和棉子糖)作為生長(zhǎng)底物，而后者的生長(zhǎng)底物是多聚或低聚糖。另外，雙歧桿菌與乳酸桿菌的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的特性也不相同，大多數(shù)的雙歧桿菌主要產(chǎn)胞內(nèi)酶，而乳酸桿菌主要產(chǎn)胞外酶。雙歧桿菌與乳酸桿菌的比較見(jiàn)表2。

表2 雙歧桿菌與乳酸桿菌的比較Table 2 Comparison betweenBifidobacteriaandLactobacilia

對(duì)于單一菌株來(lái)說(shuō)，在培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)越好，酶活越高，但其對(duì)大豆異黃酮糖苷的水解效果還取決于酶水解的條件，這就要求篩選出的菌株的最適生長(zhǎng)條件要與酶水解的最適條件相吻合。因此，產(chǎn)酶能力高低是衡量菌株水解大豆異黃酮糖苷的一個(gè)重要指標(biāo)，但產(chǎn)酶能力最高的菌株不一定是最佳的發(fā)酵豆奶菌株，對(duì)綜合影響因素的評(píng)價(jià)仍有待進(jìn)一步研究。

4 展 望

隨著大豆異黃酮苷元具有的諸多有益生物活性正逐漸被人們認(rèn)識(shí)，富含大豆異黃酮活性苷元的保健食品有著很好的市場(chǎng)前景。利用產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力強(qiáng)的益生菌菌株發(fā)酵豆奶轉(zhuǎn)化豆奶中的大豆異黃酮糖苷為活性苷元，該發(fā)酵過(guò)程簡(jiǎn)單，利于工業(yè)化，而益生菌本身有益人體腸道健康，應(yīng)用于豆奶產(chǎn)品中豐富了發(fā)酵豆制品的種類(lèi)，提高了豆奶的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值。另外，發(fā)酵豆奶與發(fā)酵牛奶相比，風(fēng)味獨(dú)特，價(jià)格低廉，膽固醇和飽和脂肪含量低，且適宜“乳糖不耐癥”人群飲用，因而，富含益生菌的發(fā)酵豆奶作為一種新型發(fā)酵產(chǎn)品必將受到廣大消費(fèi)者的歡迎。

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Research Progress in Biotransformation of Soybean Isoflavone Glycosides by β- Glucosidase and Probiotics

HAN Ting1，CHENG Gang2，LIU Ying1，HUANG Wen1,*
(1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070, China；2. College of Life Science, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

The isoflavone glycosides in soybeans and their prepared products are difficult to digest and absorb in human body. In current paper, research progress in biotransformation of soybean isoflavone glycosides to improve bioavailability through β-glucosidase at home and aboard has been reviewed. The transformation of isoflavone glucosides by exogenous β-glucosidase and β-glucosidase-producing probiotics has been discussed in detail.

soybean isoflavone；β-glucosidase；hydrolysis；probiotics

TS201.2

A

1002-6630(2010)09-0333-05

2009-12-15

韓婷(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：hanting11623@163.com

*通信作者：黃文(1968—)，女，副教授，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：huangwen@mail.hzau.edu.cn