膽胃舒顆粒對豚鼠膽囊平滑肌 CCK-A受體的影響

郭莉芳 劉輝賢 邱錦芳 王天星 李 愷 郭紹舉 李 健

保膽治療膽囊結石的優點是既去結石又保留膽囊,保留了膽道系統結構和功能的完整性,但其最大的問題是如何防止膽囊結石的復發。為此,2009年 1～3月我們從動物實驗入手,探討膽胃舒顆粒預防膽囊結石復發的機制,現將方法和結果報道如下。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 動物 實驗用 Hartley豚鼠 90只,由廣東省實驗動物中心提供。級別:普通級。體重:250～350 g。許可證號:scxx(粵)2003-0002。

1.1.2 主要試劑 (1)TRIZOL試劑,為美國 Technolo-gies公司產品。(2)逆轉錄試劑盒Access RT-PCRSystem為美國Promega公司生產。(3)豚鼠內參 β-actin引物:上游(625-649,24 bp):5'-ctg act gac tac ctc atg aag atc-3';下游(872-852,21 bp):5'-gga agg aag gct gga aga gtg-3'。PCR產物長度:248 bp。(4)豚鼠 CCK-A受體引物:上游(367-386,20 bp):5'-tca tcc cca atc tgc tca ag-3'。下游(658-639,20 bp):5'-cac ata ttc gcg gtc tgg tt-3';PCR產物長度:292 bp。

1.1.3 藥品 膽胃舒顆粒為我院消化科經驗方,由我院制劑室提供。組成:柴胡 15g,白芍 20 g,金錢草 15g,白術 15g,郁金 15 g,內金 15 g,黃芪 15 g,田七 5g,香附 15g,蒲公英 15g,海螵蛸 20 g,甘草 5g。

1.1.4 飼料 (1)標準豚鼠飼料。(2)膽固醇致石飼料。其中標準豚鼠飼料 95.45%,酪蛋白 1%,蔗糖 1.5%,豬油 1%,纖維素 1%,膽酸 0.02%,膽固醇 0.05%。酪蛋白由廣東環凱微生物科技公司提供,批號:200703316;膽固醇由廣州器化醫療設備有限公司提供,批號:080608;纖維素由廣州器化醫療設備有限公司提供,批號:080403;膽酸為瑞士分裝,批號:375217/227103。飼料均由廣東省動物中心提供。許可證號:scxx(粵)2008-0009。

1.1.5 所需主要儀器 凍存管、液態氮罐。

1.1.6 其他 實驗用的刀、剪、鑷子及玻璃制品均 200℃高溫 2 h烘烤處理。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將 90只豚鼠隨機分為 3組,每組 30只。空白組:喂養普通飼料 40 g/只?d-1;模型組:喂養膽固醇結石致石飼料 40 g/只?d-1;治療組:喂養膽固醇致石飼料 40 g/只?d-1,并加用膽胃舒顆粒溶液 2ml灌胃。

1.2.2 處理 (1)實驗 2個月后每組分為空腹組、餐后組兩亞組,空腹組禁食 24h,在豚鼠眼眶處注射空氣致死,剖開腹腔,用血管鉗阻斷膽囊管,取下膽囊,用注射器抽出膽汁以備檢測。餐后組禁食 12 h后,給液體脂餐 15ml/kg體重灌胃,30min后剖腹取材,以備檢測膽囊收縮功能。(2)膽囊平滑肌組織樣本的提取與保存:完整取下膽囊,縱形剪開,收集膽汁沉積物,濾紙吸凈;然后去掉黏膜及漿膜,保留平滑肌,最后將平滑肌組織裝入凍存管并置入液氮罐中保存。

1.2.3 檢測指標 (1)膽囊平滑肌中CCK-A受體數量測定按改良 UPP法及放射配基結合法(RBA)。將膽囊平滑肌置于 10ml預冷的勻漿緩沖液中(含蔗糖 250mmol/L,HEPES 10 mmol/L,大豆胰蛋白酶抑制劑 0.01%)充分剪碎,于電動中速勻漿器中勻漿(冰浴),每次 3min,共 3次。充分勻漿后,轉移至干凈離心管,2 500 r/min(4℃)離心 5min。收集上清液于干凈離心管,收集沉淀于勻漿緩沖液,重新勻漿、離心,收集上清液。然后,合并兩上清液,20 000 r/m in(4℃)離心 45 m in,收集沉淀,加入 HEPES緩沖液(含 HEPES 25 mmol/L,MgCl22.5mmol/L,NaCl 137mmol/L,NaH2PO40.7mmol/L,Glucose 10mmol/L,明膠 1%)搖勻,即為粗制膜受體。部分粗制膜受體以牛血清白蛋白為標準,用 Lowery法測定蛋白含量,其余用于配體結合反應。含膜蛋白 50μg的 HEPES緩沖液 300μl分別和不同濃度的 125I-BH-CCK-OP硫酸酯(1×10-11～1×10-9)反應,非特異性結合管另加入 1 000倍過量的未標記 CCK-OP硫酸酯。反應溫度為 25℃,pH 6.5,時間 30m in,冰冷 HEPES緩沖液 900μl終止反應。離心法(4℃,4 500g,20min),收集沉淀,測定放射性計數,利用計算機獲得 CCK-A受體的最大結合容量(數量)。(2)膽囊成石狀況、膽囊收縮功能測定。膽囊成石情況判定:解剖膽囊,以肉眼觀察膽囊內有無膽石或膽泥,若膽汁內存在成型、粗大顆粒者定性為結石,其成份用紅外光譜分光光度計定性;膽囊收縮功能:剖腹后自然狀態下測量膽囊最長長徑(L),及相互垂直兩橫徑(W,H),膽囊體積(v)=0.52×L×W×H(cm3),膽囊收縮功能 =(餐前體積-餐后體積)/餐前體積 ×100%。

1.3 統計學方法

將所得數據用 SPSS 10.0軟件進行統計分析,計量資料采用 t檢驗,計數資料采用 Fisher確切概率法。

2 結 果

本研究共有 7只動物死亡(占總樣本數的 5.6%),其中模型組中有 4只動物死亡,治療組中有 3只動物死亡。

2.1 各組動物膽結石發生情況

以肉眼所見棕黑色泥沙樣結石及絮狀沉淀物作紅外光譜鑒定為膽固醇結石作為成石標準:模型組成石率為 92.30%,治療組成石率為 14.81%,顯著低于模型組(P＜0.05)。見表 1。

表1 各組動物成石率比較 例

2.2 各組豚鼠膽囊收縮功能比較(表 2)

表2 各組膽囊收縮功能比較±s,%)

表2 各組膽囊收縮功能比較±s,%)

注:與模型組比較,△P＜0.01,*P＜0.05

組別 例數 膽囊收縮率空白組 30 68.63±5.79△模型組 26 41.16±4.79治療組 27 65.25±6.24*

2.3 各組 CCK-A受體比較(表 3)

表3 各組膽囊組織 CCK-A受體的變化 (±s,fmol/mg pro)

表3 各組膽囊組織 CCK-A受體的變化 (±s,fmol/mg pro)

注:與模型組比較,△P＜0.01,*P＜0.05

組別 例數 最大結合容量空白組 30 62±15△模型組 26 30±11治療組 27 58±12*

3 討 論

膽囊結石是臨床常見病,據中華外科學會膽道學組 1995年底公布的調查報告,膽囊結石幾乎占膽石病的 80%[1]。中醫認為肝失疏泄,膽汁排泄不暢,淤滯日久,聚而成石。故各種病理因素導致膽氣不舒是膽囊結石的基本病機。我們科室長期采用內鏡微創保膽取石術(MC)方式,術后配合膽胃舒顆粒,預防結石復發[2]。

膽胃舒顆粒專為膽結石術后防止結石復發設計,方中金錢草、柴胡、郁金、香附等利膽、疏肝、止痛;黃芪、白術、海螵蛸等健脾、益氣、和胃;田七、雞內金、郁金等活血、化瘀、散結;蒲公英、金錢草等清熱、化濕;白芍、甘草緩急止痛。能促進消化系統功能,增強體質,明顯促進膽汁分泌、代謝及排泄,增強膽囊的收縮功能,排出膽囊內淤積及有形微粒,從而有效防止膽囊結石的復發。

本研究顯示,模型組的膽囊收縮功能明顯低于治療組,而CCK-A受體較治療組降低,說明CCK-A受體與膽囊收縮功能呈正相關,這在基因水平上支持 CCK受體在膽囊結石形成中的重要作用,同時也說明CCK受體數目減少有其分子病理基礎,此結果與陳勝報道結果相一致[3];同時,膽囊結石患者膽囊收縮功能下降與CCK-A受體下降相關,鄭培永等[4]研究表明:病人膽囊組織中 CCK-A受體有降低的趨勢。以上表明 CCK-A受體在膽囊運動調節中起重要作用,同時提示CCK-A受體減弱是膽石病患者膽囊收縮功能減弱的重要原因:CCK-A受體下調,蛋白質合成減少,從而膽囊對CCK敏感性降低,膽囊收縮減弱。主要表現為膽汁淤積,膽固醇結晶析出,進而形成結石。

本研究還發現,治療組的結石率明顯低于模型組,而且膽囊收縮功能、CCK-A受體最大結合容量均優于模型組,保證了膽囊收縮功能,防止膽囊結石的發生。至于利膽健脾法為主中藥調節膽囊平滑肌CCK-A受體的作用機制,可能有上調膽囊平滑肌CCK-A受體增加CCK與 CCK-A受體的親和力、降低膽汁中膽固醇的濃度、減輕其對膽囊平滑肌細胞膜的傷害、促進膽汁的腸肝循環的作用,詳細機制尚需進一步的研究。

[1] 中華外科學會膽道外科學組.我國膽石病十年來的變遷[J].中華外科雜志,1995,33(11):652-658.

[2] 李 健,楊卓欣,黃明河,等.微創保膽內鏡取石術加防石膠囊治療膽囊結石的初步觀察[J].中國中醫藥科技,2003,10(1):50-51.

[3] 陳 勝,韓天權,蔣 渝,等.膽囊結石患者膽囊動力學紊亂機制的研究[J].中華外科雜志,1998,36(1):14.

[4] 鄭培永,章學林,朱培庭,等.膽囊結石病肝氣郁結證與 CCKAR和VIPR基因表達的相關性研究[J].中國中西醫結合外科雜志,2004,10(5):346-348.