印度塊菌水溶性多糖的單糖組成與抗氧化活性研究

羅 強，顏 亮，吳俐莎，張 杰，楊志榮，孫 群*

(四川大學生命科學學院，生物資源與生態環境教育部重點實驗室，四川 成都 610065)

印度塊菌水溶性多糖的單糖組成與抗氧化活性研究

羅 強，顏 亮，吳俐莎，張 杰，楊志榮，孫 群*

(四川大學生命科學學院，生物資源與生態環境教育部重點實驗室，四川 成都 610065)

采用水提醇沉法對印度塊菌子實體水溶性粗多糖進行提取，并通過酶法-Sevag法聯用脫蛋白，DEAE52纖維素Sephadex G-100柱層析對其進行分離純化，得到主要多糖組分TIP-A。采用高效凝膠滲透色譜(HPGPC)對其均一性進行驗證，測定出相對分子質量(Mr)為17500。氣相色譜質譜聯用(GC-MS)分析表明，TIP-A是由D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖組成的均一雜多糖，物質的量比約為7:2:2:2。對TIP-A抗氧化活性研究表明，其對羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O2·)、1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基有較強的清除能力，半抑制質量濃度(IC50值)分別為1.06、1.02、1.13mg/mL。對過氧化氫(300mmol/L)誘導的PC12細胞損傷有較好的抑制力，具備開發成天然抗氧化劑的潛力。

印度塊菌；多糖；單糖組成；抗氧化活性

印度塊菌(Tuber indicum)是一種生長在森林地表的食藥用真菌，屬子囊菌亞門、塊菌目、塊菌科、塊菌屬，主要分布在中國的四川和云南兩省，與歐洲的黑孢塊菌在外形上非常相似。作為亞洲著名的黑塊菌，印度塊菌常作為調味品、香水和化妝品工業的原料出口歐洲。據報道，塊菌中含有豐富的蛋白質、氨基酸、碳水化合物、麥角固醇、甾醇等營養物質和芳香成分[1-2]。另有研究者從中分離出具生物活性的物質如α-雄烷醇、神經酰胺、塊菌多糖等[3-5]。其中的塊菌多糖具有抗腫瘤，調節免疫的作用。

自20世紀50年代以來，大量研究表明一些食藥用真菌多糖具有抗氧化、免疫調節、抗腫瘤等重要的生物活性，因此食藥用真菌多糖的分離和生物活性研究已逐漸成為國內外研究的熱點。抗氧化是真菌多糖的重要

應用領域之一，可應用在食品、保健品、化妝品等多種產品中。與其他外源性抗氧化劑相比，真菌多糖具有低毒、副作用小、來源廣等特點。迄今為止對藥食用真菌多糖研究得比較深入的是香菇、茯苓、靈芝、姬松茸多糖等[6]，未見對印度塊菌多糖組成分析和抗氧化作用的報道。

本研究通過水提醇沉法得到一種印度塊菌中性多糖的粗提物，經分離純化后得到均一多糖TIP-A，利用高效凝膠滲透色譜(HPGPC)測定其相對分子質量，氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用分析其單糖組成，并對TIP-A進行羥自由基(·OH)，超氧陰離子自由基(O2·)，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力測定和體外過氧化氫誘導PC12細胞損傷的抗氧化活性研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮印度塊菌子實體(采集自四川省攀枝花市，海拔1300～1800m)由攀枝花農林科學院鑒定為印度塊菌(Tuber indicum Cooke et Massee)。PC12 細胞株由中國科學院細胞生理研究所提供，保存于液氮中。

DEAE-cellulose 52、Sephadex G-100 (Phamacia 進口分裝) 國藥集團化學試劑有限公司；D-阿拉伯糖(DAra)、D-半乳糖(D-Gal)、D-木糖(D-Xyl)、L-鼠李糖(L-Rha)、D-甘露糖(D-Man)、D-葡萄糖(D-Glu)、D-山梨糖(D-Sor)、1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、四偶氮藍(NBT)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、硫代巴比妥酸(TBA)、二丁基羥基甲苯(BHT)、標準葡聚糖T500、T-100、T-70、T-10 Sigma公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV2450紫外分光光度計、GCMS-QP2010氣相色譜日本島津公司；Waters 2695高效凝膠滲透色譜 美國Waters公司；Bio-Rad imark酶標儀 美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 印度塊菌多糖的提取、分離、純化

新鮮印度塊菌子實體切片凍干后粉碎成粉末狀，取200g，用濾紙包好，放入索氏提取器，用500mL 95%乙醇反復抽提8h，除去酚類色素、脂類、單糖等醇溶性物質，晾干備用。

上述經乙醇提取后的塊菌干粉，加入2L雙蒸水，于80℃浸提4h，抽濾得提取液，重復3次。合并3次抽濾液，60℃旋轉蒸發濃縮至1L。采用酶解-Sevag法聯用脫蛋白。取脫蛋白后的粗多糖液2mL，雙氧水脫色，在紫外分光光度計400～200nm波長掃描，以檢查蛋白是否除盡。將除去游離蛋白的粗多糖液濃縮至500mL，加入4倍體積的無水乙醇，4℃過夜沉淀，10000 r/min離心，沉淀分別用無水乙醇、丙酮、石油醚洗滌各3次，冷凍干燥得粗多糖。

將粗多糖溶于適量雙蒸水中，用DEAE 52纖維素(2.6cm × 50cm)陰離子交換柱層析分離，0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L NaCl溶液梯度洗脫，流速約為2.5mL/min，每管5mL。0mol/L NaCl 洗脫得到單一組分，命名為TIP，旋轉蒸發至小體積，透析脫鹽，凍干。將TIP用適量雙蒸水溶解，用Sephadex G-100(1.6cm×50cm)分子篩層析進一步分離純化，以雙蒸水洗脫，流速為2mL/min，每管5mL。得到主要組分TIP-A，旋轉蒸發至小體積，透析脫鹽，凍干。以上層析過程，以自動分部收集器收集，苯酚-硫酸法測定[7]。

1.3.2 印度塊菌多糖主要組分的相對分子質量測定和單糖組成分析

TIP-A的相對分子質量測定采用高效凝膠滲透色譜法[8]。以標準葡聚糖T-500、T-110、T-70、T-40和 T-10建立標準曲線，通過與樣品保留時間的計算得出相對分子質量。

多糖的完全酸水解和衍生化：TIP-A 10mg，2.0mol/mL三氟乙酸(TFA) 2mL 于安瓿瓶中，封管120℃水解8h，冷卻后減壓旋轉蒸發除去TFA，再加入1.5mL甲醇溶解，減壓蒸干，重復3次，除盡T F A。向已水解的樣品中加入2mL 吡啶、2mL六甲基二硅氮烷和1mL三甲基氯硅烷。此反應體系在50℃ 溫育20min，10000r/min離心20min，上清液進樣GC-MS分析。標準單糖混合樣品按上述方法衍生后進樣。GC-MS條件參照文獻[9]。1.3.3多糖對自由基清除力測定

羥自由基清除力測定方法參照文獻[10]。以BHT為陽性對照。

式中：Ac為空白對照(未加樣品)的吸光度；As為加入樣品溶液后反應體系的吸光度；As-blank為樣品液的吸光度。

超氧陰離子自由基清除力測定采用NADH-NBT-PMS體系，方法參照文獻[11]。以BHT為陽性對照。

式中：Ac為空白對照(未加樣品)的吸光度；As為加入樣品溶液后反應體系的吸光度；As-blank為樣品液的吸光度。

DPPH自由基清除力測定按參考文獻[12]。以BHT作為陽性對照。

式中：Ac為空白對照(未加樣品)的吸光度；As為加入樣品溶液后反應體系的吸光度；As-blank為樣品液的吸光度。

1.3.4 PC12細胞的培養和塊菌多糖對過氧化氫誘導PC12細胞損傷抑制活力測定

PC12細胞采用DMEM培養基37℃含二氧化碳培養箱(5% CO2)中進行培養。過氧化氫誘導PC12細胞損傷抑制活力測定參考文獻[13]。

式中：As為加入樣品溶液和過氧化氫溶液反應液的吸光度；A0為空白對照和過氧化氫溶液反應液的吸光度；A為過氧化氫溶液的吸光度。

1.3.5 數據統計與分析

實驗數據經Oringin 8.0軟件進行統計學分析，并使用該軟件使用線性擬合法計算出IC50值。

2 結果與分析

2.1 印度塊菌多糖主要組分TIP-A的分離純化

圖1 印度塊菌水溶性多糖的層析圖譜Fig.1 Chromatogram of water-soluble polysaccharide fromT. indicum

由圖1a可知，經DEAE52 纖維素陰離子交換柱層析分級、脫色，0mol/L NaCl溶液(即雙蒸水)洗脫下來的中性水溶性多糖主要為TIP，將主要出峰段收集起來，旋蒸、透析、凍干。后面有一小峰，可能是層析中的拖尾現象，因此未收集。由圖1 b可知，經Sephadex G-100 分子篩柱層析純化，TIP-A是印度塊菌水溶性多糖的主要組成成分，因此對TIP-A進行進一步的成分和抗氧化活性分析。

2.2 TIP-A相對分子質量、單糖組成

圖2 高效凝膠滲透色譜層析圖譜Fig.2 Chromatogram of TIP-A from high performance gel permeation chromatography (HPGPC)

通過高效凝膠滲透色譜(HPGPC)對TIP-A的分析，結果顯示為單一對稱峰(圖2)，表明其為均一多糖。根據TIP-A和標準葡聚糖保留時間的比較，利用HPGPC自帶軟件積分計算出TIP-A的相對分子質量(Mr)約為17500。

圖3 標準單糖混合物氣相色譜圖(A)與TIP-A完全酸水解產物氣相色譜圖(B)Fig.3 Gas chromatogram of standard monosaccharide mixture, and monosaccharide compositions in complete acid hydrolysis products of TIP-A

將TIP-A完全酸水解后的產物硅烷化衍生，經GCMS分析，將樣品出峰與標準單糖出峰的相對保留時間和質譜結果進行比對。由圖3可知，塊菌多糖TIP-A由 4種單糖組成，分別是D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖，物質的量比約為7:2:2:2。

上述實驗結果驗證了分離純化得到的印度塊菌多糖

的主要水溶性組分TIP-A的純度與均一性，并證明其是由D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖4種單糖組成的雜多糖。

2.3 多糖抗氧化性分析結果

2.3.1 TIP-A對羥自由基的清除力

羥自由基是對機體有害的活性氧簇的一種，其化學性質非常活潑，毒性很大，幾乎能與細胞內的每一類有機物發生反應，因此機體中及時消除羥自由基，防止過量積累對保護細胞非常重要[14]。對不同質量濃度的塊菌多糖TIP-A溶液進行清除羥自由基能力測定，結果見圖4。

圖4 TIP-A對羥自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effect of TIP-A on hydroxyl free radicals

圖4表明，隨著多糖質量濃度的增大，TIP-A對羥自由基的清除能力逐漸增大，羥自由基的清除能力與多糖質量濃度呈劑量依賴性。隨著多糖質量濃度逐漸升高到3、3.5、4mg/mL，對應的清除率經顯著性差異分析，差異不顯著(P≥0.05)，羥自由基清除率對多糖質量濃度的劑量依賴性降低，這可能是由于多糖羥自由基清除率隨質量濃度升高達到飽和狀態造成的。當多糖質量濃度達到4mg/mL時，其清除率為83.13%，與1.5mg/mL的BHT的清除能力相當。塊菌多糖TIP-A對羥自由基的IC50值為1.06mg/mL，與陽性對照BHT對羥自由基IC50值 0.5mg/mL相比較高。I C50值越小說明清除力越強，說明塊菌多糖TIP-A對羥自由基清除力比BHT低，但仍有很好的效果。

2.3.2 TIP-A對超氧陰離子自由基的清除力

超氧陰離子自由基的過量積累會導致生物體損傷，從而間接的引起風濕性關節炎和老年癡呆癥等疾病，機體中超氧陰離子量的控制是十分重要的[15]。在NADHNBT-PMS體系中，不同質量濃度的塊菌多糖TIP-A溶液的超氧陰離子自由基清除能力見圖5。

圖5 TIP-A對超氧陰離子自由基的清除力Fig.5 Scavenging effect of TIP-A on superoxide anion free radicals

由圖5可知，隨著TIP-A質量濃度的增加，其對超氧陰離子自由基的清除能力逐漸增強。當質量濃度達到4mg/mL時，其清除率最大為75.01%，僅比1.5mg/mL的BHT的清除能力低7%。塊菌多糖TIP-A對超氧陰離子自由基的IC50值為1.02mg/mL，BHT 的IC50值0.49mg/mL，說明TIP-A對超氧陰離子自由基的清除力比BHT低。

2.3.3 TIP-A對DPPH自由基的清除力

DPPH是一種穩定的芳香類自由基，天然抗氧化物質對DPPH的清除能力被認為是抗氧化物質清除自由基的總能力[16]。紫紅色DPPH醇溶液在517nm波長處具有強的特征吸收峰，當存在自由基清除劑時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，由紫色轉變成淡黃色，其褪色程度與其所接受的單電子數量成定量關系，因而可以用分光光度法進行定量分析[17]。

圖6 TIP-A對DPPH自由基的清除力Fig.6 Scavenging effect of TIP-A on DPPH free radicals

由圖6可知，在實驗質量濃度范圍內，清除率隨著多糖質量濃度的增大而增大。當多糖質量濃度達到4mg/mL時，清除率為74.49%。塊菌多糖TIP-A對DPPH自由基的IC50值為1.13mg/mL，BHT 的IC50值為0.59mg/mL，說明TIP-A對自由基清除的總能力雖然比陽性對照BHT低，但效果顯著。

2.3.4 TIP-A對過氧化氫誘導PC12細胞損傷抑制活力通過MTT細胞實驗，測定了TIP-A對過氧化氫誘導PC12細胞損傷抑制活力。有研究表明過氧化氫加入培養PC12細胞的培養基中，會引起PC12細胞的凋亡[18]。

圖7 TIP-A對過氧化氫誘導PC12細胞損傷抑制活力Fig.7 Inhibitory effect of TIP-A on PC12 cell damage caused by hydrogen peroxide

由圖7可知，在陰性對照(無TIP-A加入)中，細胞全部死亡。加入多糖溶液在終質量濃度分別為5 0、100、200、400、800μg/mL時，相應的損傷抑制率分別為7.6%、19.4%、35.4%、57.9%、71.5%。因此經TIP-A預處理的PC12細胞的生存活力對TIP-A質量濃度有一定的劑量依賴性。TIP-A對過氧化氫誘導的PC12細胞凋亡有較好的抑制作用，提示TIP-A 具有開發為抗氧化應激誘導凋亡的神經保護劑的潛力。

3 結 論

本實驗采用水提醇沉法提取塊菌多糖，通過柱層析進一步分離純化，得到印度塊菌多糖TIP-A。經高效凝膠滲透色譜分析，驗證了TIP-A的均一性，測定相對分子質量(Mr)為17500。TIP-A完全酸水解產物經GC-MS分析證實由D-甘露糖，D-葡萄糖，D-半乳糖，L-鼠李糖組成，物質的量比約為7:2:2:2。

塊菌多糖對羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基都具有一定的清除能力，并隨著塊菌多糖質量濃度的增加而增強，塊菌多糖的IC50值分別是1.06、1.02、1.13mg/mL。對不同質量濃度的TIP-A抑制過氧化氫誘導PC12細胞損傷的活力測定結果顯示出：經不同TIP-A質量濃度預處理的PC12細胞，受到過氧化氫誘導的損傷程度與多糖質量濃度成負相關，損傷抑制率與多糖質量濃度成正相關，顯示出劑量依賴性。因此，印度塊菌多糖具有較強的抗氧化活性，具備開發成為天然抗氧化劑的潛力，有望作為高效、低毒、無副作用的天然抗氧化劑添加到保健食品、化妝品中，本研究為其應用提供了實驗依據。還需要進一步深入研究TIP-A的分子結構，探究其分子結構與抗氧化性之間的關系與抗氧化機制。

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Monosaccharide Compositions and Antioxidant Activity of Water-soluble Polysaccharide Isolated from Tuber indicum

LUO Qiang，YAN Liang，WU Li-sha，ZHANG Jie，YANG Zhi-rong，SUN Qun*
(Key Laboratory of Bio-Resource and Eco-environment, Ministry of Education, College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610065, China)

A water-soluble crude polysaccharide was extracted from Truffle (Tuber indicum) by water extraction and alcohol precipitation and then purified by DEAE 52 cellulose and Sephadex G-100 chromatographic column to obtain a major fraction of polysaccharide (TIP-A). The relative molecular weight (Mr) of TIP-A was determined to be 17500 by high performance gel permeation chromatography (HPGPC). In addition, gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analysis exhibited that TIP-A was a homogeneous heteropolysaccharide consisted of mannose, glucose, galactose and rhamannose with a molar ratio of 7:2:2:2. TIP-A had strong scavenging activity on hydroxyl, superoxide anion, and 1-diphenyl-2-picryldydrazyl (DPPH) free radicals and IC50values of TIP-A for three kinds of free radicals were 1.06, 1.02 mg/mL and 1.13 mg/mL, respectively. TIP-A could also significantly attenuate PC12 cell damage caused by hydrogen peroxide at the concentration of 300 mmol/L.

Tuber indicum；polysaccharide；monosaccharide composition；antioxidant activity

Q539；TS201.1

A

1002-6630(2010)23-0052-05

2010-09-06

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD27B09；2006BAD04A12)；國家“863”計劃項目(2007AA10Z320)

羅強(1985—)，男，博士研究生，研究方向為天然產物分離純化、結構與生物活性。 E-mail：killroy@163.com

*通信作者：孫群(1967—)，女，教授，博士，研究方向為微生物生物技術。E-mail：qunsun@scu.edu.cn