牛乳中主要過敏原的分離純化研究進展

蔡小虎，李 欣，陳紅兵,*，高金燕

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學中德聯合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大學生命科學與食品工程學院食品系，江西 南昌 330047)

牛乳中主要過敏原的分離純化研究進展

蔡小虎1,2，李 欣1,3，陳紅兵1,2,*，高金燕3

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學中德聯合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大學生命科學與食品工程學院食品系，江西 南昌 330047)

牛乳中含有3種主要的過敏原蛋白：酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。本文詳細敘述沉淀法、離子交換層析法、凝膠過濾層析法、羥基磷灰石層析法、疏水相互作用層析法、高效液相色譜法以及膜技術等分離純化技術在牛乳主要過敏原分離純化中的研究進展。其中，離子交換層析與凝膠層析已被廣泛使用，而沉淀法一般作為粗提純過的步驟。羥基磷灰石層析與疏水相互作用層析法也較為常見，既可單獨分離過敏原，又可與其他方法結合來分離過敏原。另外高效液相色譜法與膜技術則是進一步純化的后續工作，以提高過敏原的純度。

牛乳過敏；酪蛋白；β-乳球蛋白；α-乳白蛋白；純化

牛乳是母乳特別重要的替代品，也是新生兒最早接觸到的過敏原之一，因而牛乳過敏在嬰幼兒中最常見[1]。據調查表明，2%～3%的嬰幼兒對牛乳過敏[2]，他們當中大約85%的過敏患者隨著年齡的增長到青年時期會產生免疫耐受，而另外15%的患者為終身過敏[3]。牛乳中包含20多種蛋白，這些牛乳蛋白都具有潛在的致敏性，但目前普遍認為酪蛋白(casein，CN)、β-乳球蛋白(Betalactoglobulin，β-Lg)和α-乳白蛋白(Alpha-lactalbumin， α-La)是主要的過敏原[4-5]。

由于高純度且具免疫活性的牛乳過敏原是牛乳過敏研究的物質基礎，所以隨著牛乳過敏研究的深入，分離純化技術的研究開發也隨之變得活躍并得到加強。目前根據牛乳中主要過敏原蛋白質的理化性質，如等電點、配體結合、兩親性質等，采用選擇性條件沉淀、色譜分離、超濾以及膜分離等方法已經成功地分離純化出各種牛乳過敏原，并滿足許多研究的要求[6]。

1 牛乳中主要過敏原蛋白的結構及理化性質

1.1 牛乳過敏原組成和理化性質

乳蛋白是乳中最有價值的成分，也含有乳中所有過敏原成分。牛乳中蛋白質含量為3.0%～3.7%，其中主要是酪蛋白(占80%)和乳清蛋白(占20%)，其組成和過敏原主要理化性質見表1[7-8]。

表1 牛乳中蛋白質的化學性質及其過敏原成分Table 1 Chemical characteristics and allergens in milk proteins

1.2 牛乳過敏原特性

1.2.1 酪蛋白

酪蛋白之所以是過敏原，是因為人乳與牛乳酪蛋白的組成和含量不同及其成分結構上的差異。

牛乳中的酪蛋白以酪蛋白膠束狀態存在，之后再與磷酸鈣形成復合體，稱為“酪蛋白酸鈣-磷酸鈣復合體”。酪蛋白占牛乳蛋白總量高達80%，酪蛋白不是單一的蛋白質，而是由αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白4種獨立的蛋白組成，還有β-酪蛋白水解得到的3種γ-酪蛋白[9]。

牛乳酪蛋白膠束粒子顆粒大，且沉淀時呈堅硬的凝塊，而人乳中的酪蛋白膠束粒子較小，而且沉淀時呈極細微的分散狀態。據報道，牛乳酪蛋白的這種凝固性質是其中大量存在的αs-酪蛋白引起的。牛乳酪蛋白中，αs-酪蛋白占60%左右，其中80%是αs1-酪蛋白。而人乳酪蛋白中幾乎不含αs-酪蛋白，以β-酪蛋白為主[10]。

αs1-酪蛋白是酪蛋白中最主要的一個過敏原，凡是對酪蛋白過敏的人，基本上都對αs1-酪蛋白過敏。它是一個含199個氨基酸的單鏈線性磷酸化蛋白，二級結構比較簡單，沒有二硫鍵[11]。

αs2-酪蛋白由207個氨基酸組成，它在所有酪蛋白中親水性最強，含有11個磷酸化殘基，結構中有3簇帶負電的磷酸絲氨酸-谷氨酸殘基，分別位于8～12、56～63、129～133氨基酸區段[12]。

β-酪蛋白是酪蛋白中過敏原性比較低的一種蛋白質，含有209個氨基酸。雖然β-酪蛋白與αs1-酪蛋白有著較低的同源性，但在結構上有些相似，都是磷酸化蛋白，脯氨酸比較平均分布，缺少二硫鍵[13]。

κ-酪蛋白分子質量較低，由169個氨基酸構成；與其他酪蛋白不同，它可與碳水化合物結合并且含有二硫鍵。它是由不同的疏水區和極性區組成的兩親性分子，由于在極性區不包括陰離子磷酸絲氨酸簇，因此不能與鈣結合[14]。

盡管αs1-、αs2-、β-、κ-這4種酪蛋白初級結構的相似性很小，但是它們仍有一些結構上的共同特征，從而能使它們明顯地區別于其他蛋白，它們都是磷酸化的蛋白，且三級結構易松散[15]。

1.2.2 乳清蛋白

乳清是奶酪及酪蛋白制品的副產品，每升乳清經烘干可得63g乳清粉，其中包括50g的乳糖和6g的蛋白，具有極高的營養價值。牛乳清蛋白中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白是乳清中兩種主要的蛋白，占乳清蛋白的75%[16]。

因母乳中不含β-乳球蛋白，所以它被認為是最主要的牛乳過敏蛋白，含有162個氨基酸殘基，5個二硫鍵，其中4個為鏈內，1個為鏈間。β-乳球蛋白的存在形式與pH值有關，在鮮牛乳中(pH6.6～6.8)，它是以二聚體的形式存在；當pH值低于3.5時二聚體離解成單體，pH值在3.5～5.2 之間時二聚體四聚化形成八聚體；pH值高于7.5時二聚體解離且構象發生變化，形成膨脹的單體，單體的分子質量在18.3kD左右[17]。

牛乳α-乳白蛋白屬于溶菌酶家族，分子質量為14.2kD，單體由123個氨基酸殘基組成。盡管牛乳α-乳白蛋白與人乳α-乳白蛋白相比有74%的氨基酸殘基相同，而且有6%的殘基化學性質相似，但α-乳白蛋白仍被認為是一種主要的牛乳過敏原[18-19]。

2 牛乳中主要過敏原分離純化方法的研究進展

2.1 牛乳中主要過敏原分離純化方法的分類

目前，牛乳中主要過敏原的分離方法很多，其分類方法也很多，本文主要以下面幾點為依據，

對牛乳中主要過敏原的分離純化方法進行分類：1)根據過敏原溶解度不同，主要是利用過敏原在鹽或酸中的溶解度不同，而達到分離的目的，包括鹽析沉淀法和等電點沉淀法；2)根據過敏原帶電性質不同，利用過敏原在層析柱中帶電性不同來分離各種蛋白，包括陰離子交換層析和陽離子交換層析；3)根據選擇性吸附不同，主要是根據柱材吸附過敏原的能力不同而使其分

離，包括疏水作用層析和羥基磷灰石層析；4)根據過敏原分子大小不同，利用過敏原的分子質量不同，使一些過敏原易通過，而另一些過敏原不易通過，甚至不能通過，以達到分離純化目的，包括膜技術和凝膠層析。

2.2 鹽析沉淀法

蛋白質在低鹽濃度下的溶解度會隨著鹽溶液濃度升高而增加，此稱鹽溶；而當鹽濃度不斷上升時，蛋白質的溶解度又以不同程度下降并先后析出，此稱鹽析，從而達到分離純化的效果。在牛乳主要過敏原的分離純化中常用硫酸銨來粗分離這些過敏蛋白。

Caessens等[20]利用此法分離得到的β-乳球蛋白回收率為68%，純度為86%。但是，目前此法很少單獨使用，常作為一個前處理的步驟來粗提純過敏原，若要進一步提純，須與其他方法結合，如離子交換層析和凝膠層析等。

2.3 等電點沉淀法

蛋白質在等電點時溶解度最低，根據牛乳中各種過敏原具有不同的等電點的特點進行分離的方法稱為等電點沉淀法。用于提取后去除雜蛋白，通過調節提取液的pH值使某些與待提純的(目的)蛋白質等電點相距較大的雜蛋白從溶液中沉出。此法也很少單獨使用，常與鹽析法結合使用。

張艷等[21]利用在堿性條件下αs-酪蛋白比β-酪蛋白對 Ca2+親和性更高，以及在酸性pH值和低溫下β-酪蛋白可溶而αs-酪蛋白不溶的性質，對αs、β-酪蛋白進行分離純化，分離得到的αs-酪蛋白組分純度可達83.33%，β-酪蛋白純度為109.53%，其回收率分別為48.03%和31.04%。而Alomira等[22]采用調節pH值與鹽濃度相結合的方法，從乳清中成功分離了α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，所得的純度分別為90%和95%，回收率分別為89%和69%。

此法既經濟又簡便，對設備要求不高，分離得到的過敏原純度滿足進一步研究的要求，因此，作為一種較為常用的粗提方法。

2.4 離子交換層析技術

離子交換層析在純化蛋白質的層析手段中使用最為廣泛，它是以離子交換劑作為柱填充物，利用不同蛋白質表面電荷性質的不同達到分離、純化蛋白質的目的，它可以分為陰離子交換和陽離子交換兩大類，目前已經廣泛地應用于過敏原的分離純化工作中。

Johann等[23]用Source 30Q陰離子交換樹脂并且同時采用快速蛋白質液相層析技術，分離純化酪蛋白中各成分。每1.2g總酪蛋白中可回收456mg αs-酪蛋白和358mg β-酪蛋白，并且還可得到99mg κ-酪蛋白。而El-Sayed等[24]采用陽離子交換色譜分離得到的β-乳球蛋白純度為95%，回收率為78%，并同時得到純度為54%的α-乳白蛋白，其回收率為67%。進年來，離子交換層析仍是最為常用的分離純化牛乳過敏原的方法之一，操作簡便，分離效率高，已在實驗室中普遍使用。

2.5 疏水作用層析

根據蛋白質表面的疏水性差別發展起來的一種純化技術。它是利用蛋白質表面疏水性區域與固定相上疏水性配基相互作用力的差異，將不同蛋白質組分分離開來，與離子交換層析法、親和層析法相比，該方法在層析過程中蛋白質與固定相的相互作用力較弱，因此蛋白質活性在層析分離過程中不易喪失，更利于過敏原的相關免疫學性質的研究。該技術已成功地被用于過敏原的分離純化工作。

Bramanti等[25]采用TSK-Gel Ether-5PW疏水色譜柱分離酪蛋白各組分并用BCR-063R鑒定純度，所分離到αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白純度分別為76.1%、85.0%、87.9%和65.5%，而且可以在很短的時間內完成，大大提高了分離效率。

2.6 羥基磷灰石層析

羥基磷灰石層析也是分離乳清蛋白主要過敏原的常用方法，它基于羥基磷灰石對一些蛋白質的吸附作用進行分離。羥基磷灰石與生物分子之間通過這些微粒與生物分子中的官能團相互結合，生物分子中官能團的種類、數目、分子空間結構及分子大小不同，則與羥基磷灰石的相互作用不同，洗脫時間也不同，從而把它們分離開來。

Rocco等[26]采用此法分離了α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，其純度分別為84.7%和86.7%，回收率分別為48.3%和32.1%。目前，應用此法，主要是由于其具有以下兩點優勢：1)低消耗以及使用無毒性材料；2)高回收率和分離產物以自然狀態存在。

2.7 超濾和膜技術

超濾濃縮蛋白質是通過外力使蛋白質溶液通過濾膜而仍保留目的蛋白的方法。在靜壓差為推動力的作用下，原料液中溶劑及小溶質粒子從高壓的料液側被透過膜到低壓側，而原料液中分子質量相對較高的蛋白組分被膜所截留，而水和小的溶質顆粒透過膜的選擇性分離過程，從而達到分離、純化和濃縮的目的。實驗室超濾主要是針對小體積蛋白質溶液(幾毫升)，用離心力的方法使溶液很容易通過濾膜。

另外，隨著科技的進步，膜技術的出現大大提高了乳蛋白的分離效率。它是通過高分子膜的選擇透過性，以濃度差梯度、電勢梯度作或壓力梯度為推動力，在膜相際之間進行傳質，以達到不同組分的分離、純化的目的。

Goodall等[27]利用陰離子交換膜分離出的β-乳球蛋白，并進一步超濾，其純度高于99%。而Konrad等[28]

也利用超濾膜從乳清中分離出α-乳白蛋白，其純度達95%。目前而言，膜技術具有顯著的經濟效益和環保作用，被西方科技界稱為21世紀最具發展潛力的高新技術，故其發展相當迅速，應用也越來越廣泛。

2.8 凝膠層析

混合蛋白隨流動相流經裝有凝膠作為固定相的層析柱時，各物質因分子大小不同而被分離，在洗脫過程中，分子質量最大的物質因為不能進入凝膠網孔而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外，分子質量最小的物質可以進入凝膠網孔而受阻滯，流速緩慢，致使最后流出柱外。它是一種簡便而快速的分離分析技術，由于設備簡單，操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質有很高的分離效果，已在分離牛乳主要過敏原中得到廣泛應用。

如Neyestani等[29]用DEAE-C陰離子交換層析和Sephadex G-50凝膠過濾層析分離了β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，純度均大于95%。另外，蔣紅玲等[30]用凝膠過濾層析分離到的β-乳球蛋白和α-乳白蛋白純度均大于90%。此法常同一些粗提純方法結合使用，作為進一步提純，以獲得更高純度的過敏原。由于此法分離所得過敏原純度高，設備簡單，無須太大投入，目前常與離子交換層析結合，被國內外廣泛使用。

2.9 高效液相色譜層析

高效液相色譜層析是一個高效快速分離化合物的方法，由于其速度快、分辨率高、重復性好、靈活性強、適用面廣、靈敏度高等特點，使它在近年生物大分子的分離和純化方面占據了極其重要的地位。它能有效地分離各種多肽混合物，尤其適用于分子質量不大的蛋白質和多肽物質的分離、純化和鑒定，在牛乳過敏原分離純化中已成功地得到應用。

王娟等[31]用反向高效液相色譜法(reversed phase high performance liquid chromatography，RE-HLPC)分離到的各過敏原蛋白回收率均相當可觀，其中αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白的回收率分別為94.3%、83.3%、91.9%和80.7%，乳清的回收率為91.8%，其純度均在99%以上。而Schlatterer等[32]利用反向高效液相色譜分離到的β-乳球蛋白純度大約99%，回收率為55%。

3 結 語

牛乳雖然有極高的營養價值，但其過敏源性也不容忽視。開展牛乳主要過敏原的研究有重大意義，解決好這些過敏原的分離技術成為其開發利用的重要一環。目前，關于牛乳主要過敏原分離純化的技術雖然很多，但仍有兩點問題需要考慮：1)一些純化方法的回收率及純度不是很高，但操作簡便，對設備要求不高，而一些方法雖然回收率和純度高，但成本卻較貴，因此，從生產成本和經濟效益來看，有待于進一步研究；2)在牛乳過敏原的分離純化中，往往使用一種方法不能達到分離效果，因此需要同時采用兩種或多種不同的分離純化方法，起到提取高純度過敏原的目的。

因此，牛乳主要過敏原的分離純化技術有待于進一步研究，而同時采用多種提純方法純化過敏原也將成為今后的主要發展趨勢，并且，隨著人類對牛乳過敏的越來越重視，牛乳過敏原的分離純化技術也將得到更深入的研究，使其既經濟又有效的分離純化牛乳中各主要過敏原。

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Research Progress in Isolation and Purification of Major Allergens from Bovine Milk

CAI Xiao-hu1,2，LI Xin1,3，CHEN Hong-bing1,2,*，GAO Jin-yan3
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China；3. Department of Food Science, School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

The bovine milk contains three kinds of major allergen proteins such as casein, β-lactoglobulin and α-lactalbumin. This article has reviewed research progresses on purification methods of major milk allergens. The purification methods including precipitation, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, hydroxyapatite chromatography, hydrophobic interaction chromatography, high performance liquid chromatography and membrane technology have been discussed. Among them, ion exchange chromatography and gel filtration have been used widely, and precipitation method has been generally used in the rough purification step. Although hydroxyapatite chromatography and hydrophobic interaction chromatography are also common for the purification, they can not be used to isolate allergens individually and need to combine with other methods for the separation of allergens. High performance liquid chromatography and membrane technology are suitable for the follow-up purification to improve the purity of allergens.

milk allergen； casein；β-lactoglobulin；α-lactalbumin；purification

TS201.2

A

1002-6630(2010)23-0429-05

2010-08-11

教育部“新世紀優秀人才支持計劃”項目(NCET-08-07-04)；國家自然科學基金項目(0860220)；南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室目標導向項目(SKLF-MB-200807)；江西省青年科學基金項目(2009GQN0089)

蔡小虎(1986-)，男，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：cxhglamour@163.com

*通信作者：陳紅兵(1967-)，男，教授，博士，研究方向為食品營養與安全。E-mail：chbgjy@hotmail.com