Taqman-MGB探針RT-PCR方法檢測食品中脊髓灰質炎病毒

李 想，黃 一,2，潘良文,*，盧鐘山，張舒亞，呂 蓉，劉月明，高 琴

(1.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135；2.華東理工大學生物工程學院，上海 200237)

Taqman-MGB探針RT-PCR方法檢測食品中脊髓灰質炎病毒

李 想1，黃 一1,2，潘良文1,*，盧鐘山1，張舒亞1，呂 蓉1，劉月明1，高 琴1

(1.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135；2.華東理工大學生物工程學院，上海 200237)

目的：建立食品中脊髓灰質炎病毒Taqman-MGB探針實時熒光RT-PCR檢測方法。方法：在脊髓灰質炎病毒基因組2A區設計引物和探針，對3種血清型脊髓灰質炎病毒進行單獨和同時檢測。通過參照分子建立標準曲線，對人工接種病毒的牡蠣、藍莓、生菜和水食品樣品進行檢測。結果：建立的檢測體系分別高度特異于相應血清型病毒檢測，對3種血清型脊髓灰質炎病毒進行單獨和同時檢測的下限均為2拷貝參照分子DNA。基于參照分子建立的4條標準曲線具有很好線性關系(R2＝0.999)和較高反應效率(1.01～1.04)。對4種食品樣品的分析表明，建立的實時熒光RT-PCR方法可穩定檢測到各添加濃度脊髓灰質炎病毒。結論：建立的Taqman-MGB探針實時熒光RT-PCR檢測體系適于食品中脊髓灰質炎病毒的檢測。

脊髓灰質炎病毒；實時熒光RT-PCR；Taqman-MGB探針；食品；參照分子

近年來，由于食用受病毒污染食品而引起的疾病爆發已成為國際上重點關注的食品安全事件之一，其中源于腸道病毒而引發的疾病占67%以上。作為一種致病性腸道病毒，脊髓灰質炎病毒(polioviruses，PVs)雖然已在全世界基本消滅，但由于脊髓灰質炎病毒疫苗的廣泛使用，其突變株近幾年在多個國家引發了疫苗衍生脊髓灰質炎病毒感染事件[1-3]。據世界衛生組織統計，2009年1至11月間疫苗衍生脊髓灰質炎病毒感染病例已升至151例，野生型病毒感染病例近1500例[4-5]。為了加強PVs的監控，防止“病從口入”至關重要。由于PVs

主要在人類排泄物和污水中存活，貝類及某些即食性水果和蔬菜存在受病毒污染的風險[6-7]。因此建立食品中PVs快速高效檢測方法是保障食品安全的重要技術手段之一。

近幾年國內外相繼報道了檢測PVs的巢式PCR、常規PCR及ELISA等方法[8-10]，這些檢測技術多以患兒的糞便或分泌物樣本為檢測目標。與人類排泄物相比，食品中病毒含量更低，干擾因子更加復雜，因此需要針對性和靈敏度更高的檢測方法。隨著分子生物學技術的發展，實時熒光PCR技術已廣泛應用于特征性DNA的檢測。其中近年發展起來的Taqman-MGB探針由于具有特異性好、靈敏度高、穩定性好、優化步驟簡單、結果精確、分辨率高等優點而逐步應用于檢測中[11-13]。本研究基于Taqman-MGB探針建立分別檢測血清Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊髓灰質炎病毒的快速、高靈敏度方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型PVs滅活疫苗懸浮液由美國加州大學學者惠贈，A9、A16、B2、B3和B5型滅活柯薩奇病毒和含GⅡ型諾如病毒糞便樣品購自中國疾病預防控制中心病毒預防控制研究所。

PBS緩沖液(0.14mol/L NaCl，0.003mol/L KCl，0.00175mol/L KH2PO4，0.01mol/L Na2HPO4，pH 7.5) 上海生工生物工程有限公司；甘氨酸緩沖液(0.1mol/L甘氨酸，0.3mol/L NaCl，pH9.5)；PEG 8000溶液(16% PEG 8000，0.525mol/L NaC1)；TIANamp病毒RNA提取試劑盒(產品序列號SD101) 天根生物科技有限公司；Prime ScriptTM反轉錄試劑盒(產品序列號DRR037A) 、Premix Ex TaqTM實時熒光擴增試劑盒(產品序列號 DRR039A) 寶生物工程有限公司；醋酸/硝酸混合纖維素濾膜(產品序列號R7SN20186) 密理博貿易有限公司；5810R型臺式離心機、Mastercycler Gradient PCR儀、Thermomixer comfort型恒溫混勻器 Eppendorf公司；ABI PRISM 7300型序列分析系統 Applied Biosystems公司。

1.2 引物與探針

對GenBank數據庫中已公布的PVs 各病毒株cDNA序列進行比對和分析，尋找各血清型間相對保守，與其他腸道病毒株同源性較低的區域，選擇PVs基因組2A區設計引物和探針。由于簡并引物對實時熒光PCR反應效率影響較大，對Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型PVs分別設計了一套特異性引物和探針FP1/RP1/Probe1、FP2/RP2/Probe2和FP3/RP3/Probe3(表1)，3對引物擴增區域在3種血清型中所處位置相近。進行Blast比對后，設計的引物和探針僅與脊髓灰質炎病毒相關序列匹配。

表1 3種血清型脊髓灰質炎病毒實時熒光RT-PCR檢測引物和探針Table 1 Primer and probe sets used for real-time RT-PCR detections of serotypes 1, 2 and 3 of polioviruses

1.3 病毒滅活疫苗、糞便樣品中病毒RNA提取

PVs滅活疫苗、含諾如病毒糞便、滅活柯薩奇病毒樣品使用TIANamp病毒RNA提取試劑盒進行RNA提取和純化。

1.4 脊髓灰質炎病毒滅活疫苗懸浮液中病毒拷貝數測定

分別取140μLⅠ、Ⅱ、Ⅲ型PVs滅活疫苗懸浮液(每種血清型取10-4、10-5和10-63個稀釋液)進行病毒RNA提取，采用本研究建立的實時熒光檢測體系進行擴增，重復3次，通過建立的標準曲線計算樣品病毒拷貝數。經計算Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型PVs懸浮液濃度分別為2.52×106、5.36×106拷貝/μL和6.55×106拷貝/μL。

1.5 食品樣品中病毒的人工接種

1.5.1 貝類和果蔬樣品

稱取5g牡蠣腸腺組織，將140μL分別為2700、270和54拷貝Ⅰ型脊髓灰質炎病毒懸浮液注入牡蠣腸腺組織中，勻漿后轉移至50mL離心管中。

稱取15g 新鮮藍莓或生菜樣品，將140μL分別為2700、270和54拷貝Ⅰ型脊髓灰質炎病毒懸浮液均勻點種于蔬果外表面，室溫放置30min，使病毒懸浮液完全被蔬果表面吸附并干燥。

分別取一份不含脊髓灰質炎病毒污染的貝類或蔬果樣品作為陰性對照。Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰質炎病毒的接種方法同上。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒同時添加的樣品中每種血清型病毒分別占總量的1/3，接種方法同上。

1.5.2 水樣

分別取140μL為2700、270和54拷貝Ⅰ型脊髓灰質炎病毒懸浮液加入100mL自來水中，充分混勻，室溫放置60min。同時制備一份不含脊髓灰質炎病毒的100mL水樣作為陰性對照。Ⅱ型和Ⅲ型脊髓灰質炎病毒接種方法同上。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒同時添加的水樣中每種血清型病毒分別占總量的1/3，接種方法同上。

1.6 食品中脊髓灰質炎病毒富集和RNA提取與純化

1.6.1 貝類樣品

采用參考文獻[14]的方法。

1.6.2 果蔬樣品

將樣品放入50mL離心管中，加入35mL甘氨酸緩沖液，37℃振蕩30min。4℃ 9703r/min離心30min。轉移上清液至一新離心管，加入等體積PEG8000溶液，4℃放置過夜。4℃ 10629r/min離心30min，棄上清液。向沉淀中加入140μL PB S緩沖液使沉淀懸浮均勻。采用TIANamp病毒RNA提取試劑盒提取病毒RNA。

1.6.3 水樣

將100mL水樣分次通過直徑為47mm，孔徑為0.45μm的醋酸/硝酸混合纖維素濾膜進行過濾；取出濾膜，平整放于聚乙烯薄膜袋中，加入113 1.2μL Buffer RL-carrier RNA混合液(TIANamp病毒RNA提取試劑盒)，劇烈振蕩30s；室溫浸泡濾膜20min，將液體完全轉移到15mL離心管中。采用TIANamp病毒RNA提取試劑盒提取病毒RNA。

1.7 反轉錄反應

反應體系為10μL，包括1×緩沖液，0.5μL反轉錄酶混合液，0.5μL Oligo (dT) (0.125μmol/L)，5μL RNA溶液。反應條件為：37℃，15min；85℃，5s。

1.8 實時熒光RT-PCR反應和標準曲線制備

反應體系為20μL，包括1×Premix Ex Taq，上下游引物各0.2μmol/L，探針0.2μmol/L，1×ROX熒光染料，2μL病毒cDNA或參照分子DNA溶液。實時熒光擴增條件為：95℃，10s；95℃，5s；60℃，31s；45個循環。

為了建立標準曲線，將實驗室前期工作構建的3種參照分子DNA分別稀釋至106、105、104、103、102、10拷貝/μL。進一步稀釋至5、2和1拷貝/μL用于檢測下限分析。對3種血清型病毒同時檢測的標準曲線制備，則采用含有等量3種參照分子的稀釋液，進行10倍梯度稀釋，將3對引物和探針混合后進行擴增。反應均重復3次。在熒光擴增曲線對數期選擇域值，獲得Ct值。以Ct值為橫坐標，DNA拷貝數對數值為縱坐標作圖即得到標準曲線。PCR反應效率通過以下公式計算：E= 10－1/曲線斜率－1。對人工接種的食品樣品中脊髓灰質炎病毒的檢測，則通過上述獲得的標準曲線和方程計算拷貝數，并對3次重復間的拷貝數相對標準偏差(RSD)進行計算。

2 結果與分析

2.1 實時熒光RT-PCR檢測體系特異性測試

為了鑒定建立的檢測體系的特異性，以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型PVs， B2、B3、B5、A9和A16型柯薩奇病毒及GⅡ型諾如病毒cDNA為模板，分別采用設計的3套引物和探針進行RT-PCR擴增。采用引物和探針FP1/RP1/ Probe1進行擴增時，僅有Ⅰ型脊髓灰質炎病毒cDNA模板產生明顯的擴增曲線，以其他病毒或血清型cDNA(包括諾如病毒、柯薩奇病毒、Ⅱ、Ⅲ型PVs)為模板時均未出現熒光信號增幅(表2)。同樣地，利用引物和探針FP2/RP2/Probe2和FP3/RP3/Probe3進行擴增時，只有分別以Ⅱ型和Ⅲ型脊髓灰質炎病毒cDNA為模板才可見顯著的熒光增幅。因此，針對Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型PVs建立的Taqman-MGB探針實時熒光檢測體系分別高度特異于對應血清型脊髓灰質炎病毒檢測。

表2 實時熒光RT-PCR檢測體系特異性測試Table 2 Specificity tests of real-time RT-PCR detection systems for serotypes 1, 2 and 3 of polioviruses

2.23 種血清型脊髓灰質炎病毒的單獨檢測

2.2.1 標準曲線制備

分別以106、105、104、103、102、10拷貝/μL 6個水平的參照分子pMD18-PV1、pMD18-PV2和pMD18-PV3 DNA為外標準品構建標準曲線。擴增曲線、標準曲線和對應方程見圖1A～1C。結果顯示，針對Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型PVs檢測建立的標準曲線PCR反應效率分別為1.04、1.01和1.03，均接近1，說明擴增反應基本未受抑制因子影響。Ct值與模板拷貝數對數的相關系數(R2)均為0.999。對實時熒光PCR體系可重復性分析表明，Ct值標準偏差(s)均小于0.25，介于0.025至0.211之間(表3)，在可接受范圍內，說明建立的檢測體系具有較好的可重復性。因此針對Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型PVs建立的實時熒光檢測體系適于進一步對食品樣品的檢測。

2.2.2 檢測下限分析

分別以5、2和1拷貝/μL三個參照分子DNA溶液為模板測試檢測體系靈敏度，每個濃度DNA重復檢測10次。結果顯示包括最低1拷貝/μL模板(2拷貝/反應)

在10次檢測中均可被穩定檢出。因此，建立的3種實時熒光檢測體系的檢測下限均為2拷貝參照分子DNA。

2.33 種血清型脊髓灰質炎病毒的同時檢測

2.3.1 標準曲線制備和檢測下限分析

為了滿足口岸快速檢測的要求和簡化檢測流程，實現3種血清型病毒的同時檢測，本研究對建立的3個檢測體系進行混合用于檢測。將上述針對3種血清型病毒分別設計的3套引物和探針進行混合，對反應體系和反應條件優化后，建立了一個反應管內同時檢測3種血清型PVs的實時熒光體系。

通過制備的標準曲線(圖1D)可以看出，PCR反應效率達1.01，相關系數為0.999。3次平行重復的標準偏差值介于0.004至0.244之間(表3)。對體系的檢測下限分析表明，與對3種血清型病毒分別檢測的靈敏度相似，對3種血清型病毒同時檢測可擴增到的最低模板量亦為2個拷貝參照分子DNA。

2.3.2 同時檢測與單獨檢測體系的比較

表3 基于參照分子的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型PVs檢測體系可重復性分析Table 3 Repeatability of Ct values for serotypes 1, 2 and 3 of PVs detection based on the reference molecules

圖1 基于參照分子建立的適于3種血清型PVs單獨和同時檢測的擴增曲線和標準曲線Fig.1 Standard curves and amplification plots for three serotypes of PVs detections based on the reference molecules

表4 對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型PVs實施單獨檢測和同時檢測的比較Table 4 Comparison of separate and simultaneous detection of serotypes 1, 2 and 3 of PVs

本研究對3種血清型脊髓灰質炎病毒實施單獨檢測和同時檢測的PCR擴增反應進行了比較。以3個水平樣品cDNA為模板，通過單獨與同時檢測體系對Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型PVs的分析表明，平均Ct值差值平均值分別介于－0.11～0.043，－0.043～0.32，以及0.093～0.226之間；標準偏差值分別小于等于0.32，0.27和0.34(表4)。對3種血清型病毒實施單獨檢測與同時檢測的Ct值差異未達顯著水平，擴增曲線基本重合。由此可見，對3種血清型PVs進行同時檢測與單獨檢測效果無顯著差異。

2.4 食品樣品中脊髓灰質炎病毒的檢測

圖2 食品樣品中添加3個濃度PV3病毒的擴增曲線Fig.2 Amplification plots of four food samples inoculated with PV3

為了鑒定建立的檢測體系對食品樣品中脊髓灰質炎病毒的實際檢測效果，本研究選擇了易受病毒污染的4類食品，包括牡蠣、藍莓、生菜和水進行病毒人工接種。結果如圖2和表5所示，在4種食品樣品中分別添加I、II或III型2700、270和54拷貝病毒，擴增曲線均可穩定出現熒光增幅。拷貝數的RSD在1.8%至45.0%之間，相比較而言，較大的3個RSD值(42.8%、42.8%、45.0%)出現在添加濃度最低的54拷貝病毒的水樣中。同時添加3種血清型病毒的食品樣品檢測結果與單獨添加的結果相似，即當病毒添加量低至54拷貝時，仍可穩定獲得有熒光增幅的擴增曲線，RSD值在3.8%至40.3%之間。因此，建立的脊髓灰質炎病毒Taqman-MGB實時熒光RT-PCR檢測方法適于食品中脊髓灰質炎病毒的檢測。

表5 食品樣品中脊髓灰質炎病毒的檢測Table 5 Detection of polioviruses in four inoculated food samples拷貝數

3 討 論

近年來，包括中國在內的很多國家均發現了野生型和疫苗型PVs感染病例[1-3]。降低食源性PVs感染和擴散是防控病毒流行的一個重要方面。由于貝類、果蔬和水樣等食品樣品中病毒含量較低，建立特異性好、靈敏度高的檢測方法至關重要。基于此，本研究建立了Taqman-MGB探針實時熒光RT-PCR方法用于食品中PVs檢測。Taqman-MGB探針能分辨出模板與探針結合區一個堿基的差別，檢測特異性高[16]，且MGB探針長度在13～19個堿基[11]，對于突變度較高的病毒株間尋找適宜的檢測區域十分有利。

鑒于Taqman-MGB探針應用的諸多優點，本研究針對3種血清型PVs設計了3套引物和探針，每套引物和探針均高度特異于對應血清型病毒檢測。3套引物和探針既可用于3種血清型病毒單獨檢測，也可混合用于3種血清型病毒的同時檢測，使用更加靈活，并且單獨檢測與同時檢測效果沒有顯著差異。以參照分子為外標準品的檢測下限分析表明建立的單獨和同時檢測體系可檢

測到的最低模板量為2拷貝，較前人建立的脊髓灰質炎病毒RT-PCR檢測方法靈敏度提高至少一個數量級[8-9]。對4類易受病毒污染的人工接種食品樣品分析表明，無論實施單獨檢測還是同時檢測，對添加低至54拷貝病毒的樣品均可穩定檢測到熒光信號增幅。

因此本研究建立的脊髓灰質炎病毒Taqman-MGB探針實時熒光檢測方法適用于貝類、水果、蔬菜和水等食品樣品中PVs的檢測。

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Detection of Polioviruses in Foodstuffs by Real-time RT-PCR Based on Taqman-MGB Probe

LI Xiang1，HUANG Yi1,2，PAN Liang-wen1,*，LU Zhong-shan1，ZHANG Shu-ya1，LIU Yue-ming1，GAO Qin1
(1. Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai 200135, China；2. School of Bioengineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)

This study was aimed to develop three sero-specific real-time RT-PCR detection systems based on Taqman-MGB probes for the assay of polioviruses in foodstuffs. Primer and Taqman-MGB probe sets based on the 2A region of poliovirus genome were designed to detect three serotypes of polioviruses separately and simultaneously. Four artificially inoculated food samples, including oyster, blueberry, lettuce and water were analyzed based on the established standard curves using three reference molecules as calibrators. Sensitivity tests suggested that at least 2 copies of the reference molecule DNA could be stably detected both in the separate and simultaneous detection systems. Good linearity with the correlation coefficient above 0.999 and high reaction efficiency (1.01－1.04) were observed in four standard curves employing serially diluted reference molecule DNA as the calibrator. Three serotypes of polioviruses in four inoculated samples were successfully detected using the established real-time RT-PCR detection systems. The developed real-time RT-PCR detection systems based on Taqman-MGB probes are most suitable for polioviruses detection in foodstuffs.

polioviruses；rea1-time RT-PCR；Taqman-MGB probe；foodstuffs；reference molecule

TS201.6；R155.5

A

1002-6630(2010)10-0200-06

2009-08-05

上海技術標準專項(07DZ05026)；國家質檢總局科研項目(2007B150)；科技部世博科技專項(2009BAK43B31)；上海市科委創新平臺服務項目(10DZ2294102)

李想(1978—)，女，工程師，博士，研究方向為分子生物學。E-mail：idealne@163.com

*通信作者：潘良文(1966—)，男，研究員，博士，研究方向為食品安全檢測。E-mail：pan888@126.com