桑葉總黃酮的提取純化工藝研究

馬金秋，李丹，馬向前，張曉宇#（1.河北秦皇島市第一醫(yī)院，秦皇島市066000；.吉林省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，長(zhǎng)春市 1001；.燕山大學(xué)，秦皇島市 066004）

桑葉為桑科植物桑Morus albaL.的葉，臨床上廣泛用于利尿、降血糖、降血脂、降血壓等。桑葉富含異槲皮苷、槲皮苷、膽堿、有機(jī)酸、維生素、氨基酸[1]等保健活性成分和營(yíng)養(yǎng)成分，其中蕓香苷、槲皮素、異槲皮素、二氫山茶等黃酮類化合物占干葉重的1.0%～3.0%，是植物莖葉中黃酮類化合物含量較高的一種。黃酮類化合物是天然的抗氧化劑，具有清除人體中超氧離子自由基的生理活性，且具有抗癌、抗衰老和抗氧化等多種藥理作用，因此對(duì)桑葉中黃酮類成分提取純化工藝的探討具有重要意義。

1 材料

1.1 儀器

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；UV2265型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；W2010型數(shù)控恒溫浴鍋（上海申勝生物技術(shù)有限公司）；SK3300H型超聲儀（上海科導(dǎo)超聲儀有限公司）。

1.2 試藥

桑葉購(gòu)自秦皇島市安平大藥房，經(jīng)秦皇島市人民醫(yī)院田鳳英主管中藥師鑒定為真品；蘆丁對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):100080-200306）；硫代巴比妥酸（TBA）、二苯代苦味肼基（DPPH，美國(guó)Sigma公司）；AB-8型大孔吸附樹(shù)脂（南開(kāi)大學(xué)化工廠）；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:參考文獻(xiàn)[2]進(jìn)行。取干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，得1.05 mg·mL-1的蘆丁對(duì)照品貯備液。精密吸取蘆丁對(duì)照品貯備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入新配制的5%NaNO2溶液0.5 mL，放置5 min后，加入10%Al（NO3）30.5 mL，放置5 min，再加入4%NaOH溶液4 mL，蒸餾水定容，搖勻，放置15 min，510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以蘆丁對(duì)照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝12.78X－0.017（r＝0.998 8）。結(jié)果表明，蘆丁對(duì)照品在0.010 5～0.063 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.1.2 供試品溶液的制備:取烘干、粉碎過(guò)40目篩的桑葉樣品約1 g，精密稱定，置索氏提取器中，乙醚脫脂后揮干乙醚，將脫脂過(guò)的桑葉置于錐形瓶中，按表1和表2加乙醇浸泡30 min，超聲波提取器中提取一定時(shí)間，過(guò)濾，濾液揮干乙醇，用甲醇溶解，過(guò)濾，定容于50 mL容量瓶中，制得9個(gè)供試品溶液。

2.1.3 樣品含量測(cè)定:精密吸取供試品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，按照“2.1.1”項(xiàng)下“加5%NaNO2溶液0.5 mL”起至“510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度”操作，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮含量。

2.1.4 精密度試驗(yàn):精密吸取同一供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果，RSD＝1.19%，表明方法精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn):取同一批桑葉樣品6份，各1 g，精密稱定，按“2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算供試品溶液中總黃酮含量。結(jié)果，RSD＝2.38%，表明本方法具有較好的重復(fù)性。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn):對(duì)同一份供試品溶液，每隔1 h按“2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定1次含量，共測(cè)6次。結(jié)果，RSD＝1.95%，表明桑葉黃酮提取液在6 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn):精密稱取已知含量的樣品6份，加入一定濃度的蘆丁對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度。結(jié)果，平均回收率為98.63%，RSD＝2.02%，表明本方法回收率高。

2.2 工藝研究

2.2.1 提取溶劑的確定:根據(jù)文獻(xiàn)資料[3]確定黃酮提取的常用方法主要有熱水提取法、堿性水溶液提取法、乙醇提取法、甲醇提取法、丙酮提取法等。以1/20（W/V）的比例用沸水、80℃下的堿性水溶液（pH 9.0）、60%乙醇溶液、60%甲醇溶液和60%丙酮溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮含量。結(jié)果表明，甲醇和乙醇提取效果較為接近且優(yōu)于其他方法，鑒于甲醇毒性較高，考慮到用于食品的安全性，本試驗(yàn)黃酮提取溶劑選用一定濃度乙醇。

2.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì):為系統(tǒng)考察乙醇超聲提取桑葉總黃酮的工藝參數(shù)，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果選擇乙醇濃度（A）、提取溫度（B）、料液比（C）、超聲波輔助提取時(shí)間（D）作為考察因素，以樣品中總黃酮含量為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表1；正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2；方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 因素水平Tab 1 Levels and factors

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

通過(guò)綜合評(píng)價(jià)，各因素對(duì)總黃酮提取率影響的順序?yàn)锽＞A＞C＞D。最佳的提取工藝為A3B3C3D2，即在80℃用20倍于原料的80%乙醇超聲提取40 min。從表2可知，選用60%和80%乙醇濃度的提取率均值分別為2.411%、2.412%，并無(wú)顯著影響。因此在實(shí)際生產(chǎn)中，考慮到成本等經(jīng)濟(jì)條件，選用60%的乙醇。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn):稱取桑葉藥材，按最佳的提取工藝平行提取3次，結(jié)果總黃酮平均含量為2.52%，提取物純度達(dá)到48.7%，表明該提取工藝科學(xué)、合理、可行性強(qiáng)。

2.3 黃酮化合物的純化

對(duì)所得桑葉總黃酮粗品用AB-8型大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行純化，具體按文獻(xiàn)[4]方法進(jìn)行，略有改進(jìn)。得最佳工藝條件為:以20 mg·mL-1濃度上樣，6倍量水洗滌，70%乙醇洗脫。此條件下，乙醇洗脫物中桑葉總黃酮純度達(dá)到63.2%。

3 討論

桑葉藥食兼佳，資源豐富，是一種極有潛力的天然抗氧化劑資源，有望于研制成為高效、低毒、價(jià)廉的抗衰老保健食品或藥品。

通過(guò)對(duì)正交試驗(yàn)及方差分析結(jié)果綜合評(píng)價(jià)，最佳的提取工藝為A3B3C3D2，即在80℃用20倍于原料的80%乙醇超聲提取40 min。溫度和有機(jī)溶劑濃度在所考察范圍內(nèi)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較為明顯，而料液比和超聲提取時(shí)間在考察范圍內(nèi)影響很小。筆者采用超聲波輔助提取桑葉總黃酮的工藝方法與傳統(tǒng)工藝方法比較具有節(jié)時(shí)、節(jié)能、操作簡(jiǎn)單、提取率高等特點(diǎn)。但是試驗(yàn)中可以觀察到，超聲提取時(shí)間加長(zhǎng)，桑葉中含有脂溶性雜質(zhì)溶出也隨之增加，因此建議超聲時(shí)間為40 min。

從表2結(jié)果可以看出，乙醇濃度增大，得率增大。從理論上來(lái)說(shuō)，游離黃酮難溶于水或不溶于水，易溶于乙醇溶劑，但黃酮類化合物在植物中可與糖結(jié)合形成糖苷如蘆丁，與生物堿結(jié)合形成黃酮生物堿，因?yàn)辄S酮苷和黃酮生物堿溶于水、乙醇中，用水可提取水溶性黃酮類化合物如黃酮苷，用乙醇即可提取水溶性黃酮化合物，故乙醇濃度對(duì)提取率具有明顯影響。從表2可以看出，選用60%和80%乙醇濃度提取率均值分別為2.411、2.412，影響不顯著，因此在實(shí)際生產(chǎn)中，考慮到成本等經(jīng)濟(jì)條件，選用60%的乙醇。表3的結(jié)果表明，對(duì)于D因素，F(xiàn)值接近1，說(shuō)明因素水平間無(wú)顯著差異；B、A因素F值越大，其因素水平改變對(duì)指標(biāo)的影響較大，但由于試驗(yàn)次數(shù)較少，未見(jiàn)顯著差異。結(jié)果表明，A、B、C、D幾種因素對(duì)黃酮提取率的影響程度差異較大。

考慮到應(yīng)用正交試驗(yàn)的優(yōu)化組合提取桑葉黃酮，提取物純度為48.7%，為進(jìn)一步提高其純度，根據(jù)桑葉黃酮具有多酚結(jié)構(gòu)和糖苷鏈，產(chǎn)生氫鍵能力較強(qiáng)，采用大孔樹(shù)脂通過(guò)表面吸附、表面電性或形成氫鍵而起到較好的吸附作用。本試驗(yàn)中筆者選用了極性較好、比表面積大、交聯(lián)效果及孔隙度都較好的AB-8型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)黃酮類化合物進(jìn)行純化，選擇性地吸附黃酮類化合物，使黃酮純度提高至63.2%，從而達(dá)到純化的目的。與一般方法相比，應(yīng)用大孔樹(shù)脂純化桑葉總黃酮，能得到較高純度的總黃酮，方法簡(jiǎn)便、迅速、經(jīng)濟(jì)，結(jié)果穩(wěn)定、可靠。

[1]孫 蓮，張 煊，孟 磊，等.柱前衍生RP-HPLC法測(cè)定桑葉中16種游離氨基酸的含量[J].中國(guó)藥房，2008，19（36）:2 830.

[2]孫敏耀，唐文照，盧 霞，等.分光光度法測(cè)定不同采收時(shí)間桑葉中總黃酮[J].中草藥，2004，35（10）:1 190.

[3]張 睿，徐雅琴，時(shí) 陽(yáng).黃酮類化合物提取工藝研究[J].食品與機(jī)械，2003，22（1）:21.

[4]王 芳，勵(lì)建榮，蔣躍明.桑葉黃酮的提取純化及對(duì)油脂抗氧化活性的研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2006，21（4）:106.