RP-HPLC法測定人血漿中米氮平的濃度Δ

黃洪勇，王金寶，李恒芬，錢東麗#，師天元，郭新勝（.新鄉醫學院第二附屬醫院，新鄉市45300；.河南省生物精神病學重點實驗室，新鄉市 45300）

現代醫學認為抑郁癥的發病與遺傳因素、神經遞質、軀體、心理和性別等因素有關[1，2]。米氮平（Mirtazapine，MTZ）為全球首個去甲腎上腺素能和特異性5-羥色胺能抑制劑，具有獨特的雙重抗抑郁藥理學特性，有起效快、療效確切、耐受性好、無抗膽堿能作用等優點，目前己廣泛應用于臨床[3，4]。國外曾以監測患者體內米氮平的血藥濃度來指導臨床用藥、預警不良反應和規避風險[5]。本試驗建立了反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測定人血漿中米氮平的濃度，現報道如下。

1 材料

1.1 儀器

1100型高效液相色譜儀系統，包括G1311A自動調配泵、G1316A可調柱溫恒溫箱、G1322A在線脫氣、色譜化學工作站（美國Agilent公司）；XT-120A電子分析天平（瑞士Precisa公司）；LXJ-Ⅱ離心沉淀機（上海醫分儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

米氮平對照品（無錫華裕生物制藥有限公司，批號:080428，含量:99.6%）；內標:氯氮平對照品（美國Sigma公司，批號:010K1204）；甲醇為色譜純，正丁胺、乙酸乙酯、乙醚為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:美國Diamonsil?（250 mm×4.6 mm，5 μm）C18反相柱；柱溫:25 ℃；流動相:甲醇-0.3%正丁胺溶液（80∶20）；流速:1.0 mL·min－1；檢測波長:292 nm；進樣量:20 μL。 在該色譜條件下，色譜峰與血漿中內源性雜質峰很好分離，無干擾峰出現，米氮平和內標保留時間分別為6.59、8.07 min，主峰米氮平的有效塔板數應在9 500以上，分離度7.3，拖尾因子1.04。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 溶液的制備

取米氮平對照品約10 mg，準確稱定，加甲醇溶解，轉移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，即得。于冰箱4℃保存備用，臨用前用甲醇稀釋成所需濃度。另同法制備出濃度為10 μg·mL－1氯氮平的甲醇溶液為內標溶液。

2.3 血漿樣品處理

取400 μL含藥血漿加至10 mL具塞錐形玻璃離心管中，加入內標溶液100 μL，渦旋振蕩1 min，加入提取劑乙酸乙酯-乙醚（1∶1）1 mL，渦旋振蕩提取2 min，4 000 r·min－1離心10 min，取上層提取液置于一干燥具塞尖底試管中，再加入1 mL上述提取劑，同法操作。振蕩混合2次提取液，40℃水浴氮氣吹干，殘渣用100 μL流動相復溶后，4 000 r·min－1離心10 min，取上清液20 μL進樣。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察:取空白血漿300 μL共8份，分別加入不同濃度的米氮平對照品溶液100 μL，使血漿中藥物濃度分別為0.1、0.2、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、20.0 μg·mL－1，振蕩混勻，然后按“2.3”項下方法處理，進樣測定并記錄色譜。以米氮平血藥濃度（X）對米氮平峰面積與內標峰面積的比值（Y）進行線性回歸，得標準曲線方程為Y＝0.267X+0.031（r＝0.999 9，n＝8），結果表明，米氮平血藥濃度在0.1～20.0 μg·mL－1范圍內線性關系良好。當信噪比（S/N）＝3時，最低檢測限為0.05 μg·mL－1。

2.4.2 方法回收率及精密度試驗:取空白血漿3份，分別制備成濃度各為1.0、4.0、16.0 μg·mL－1的米氮平血漿對照品溶液，然后按“2.3”項下方法處理。每種濃度日內平行測定5次，3種濃度隔日測定1次，各5次。分別計算日內、日間精密度，并根據同一天內低、中、高3種濃度血漿對照品測定結果計算相對回收率；另制備濃度各為1.0、4.0、16.0 μg·mL－1對照品溶液并分別進樣5次，以此為標準，計算米氮平的絕對回收率，結果見表1。

表1 回收率及精密度試驗結果（n＝5）Tab 1 Results of recovery and precision test（n＝5）

2.4.3 穩定性試驗:各制備低、中、高（1.0、4.0、16.0 μg·mL－1）3種濃度的米氮平血漿樣品，于－20℃冰箱保存，分別在0、5、10、15、20 d時取出于37.5℃水浴融化后，按“2.3”項下方法處理，測定濃度。結果濃度變化的RSD＝4.85%，表明米氮平在血漿中至少放置20 d穩定。

2.4.4 患者血樣含量測定:取患者上肢靜脈血5 mL，取出血漿，平行處理3份（編號:MTZ-1、MTZ-2、MTZ-3），避光低溫保存至測定。患者的血樣測定結果見表2。

表2 患者的血樣測定結果（n＝3）Tab 2 Results of the determination of plasma sample of patients（n＝3）

由表2可以看出，RP-HPLC法測定血漿中米氮平的濃度，重復性比較好，RSD值均＜2%。

3 討論

筆者曾結合文獻[6，7]，系統比較了乙醚與乙酸乙酯的提取效率，發現二者相差不大，但乙酸乙酯作為提取劑非常不易揮散，氮氣吹干較難。本試驗選用了復合提取劑，既保持了較高的提取效率，又減少了工作量。

抑郁癥患者在藥物治療上大多聯用了一些情緒穩定劑（如卡馬西平）、鎮靜劑（如地西泮），因此，這些物質不易作為內標的首選。本試驗選用了抑郁癥患者不常聯用的氯氮平作為內標，避免了患者血樣本身對分析過程的影響，擴大了方法現實應用中的范圍。

在有關米氮平含量的體內分析方法中，熒光檢測法和毛細管電泳法樣品前處理復雜[8，9]、液相色譜-單四極桿質譜法儀器昂貴[10]、其他高效液相色譜法則分析時間過長[6]，均遠不能適應人體內米氮平的快速、準確分析。本試驗采用的RP-HPLC法具有樣品前處理簡單、分析儀器普及率高、簡便、快速、準確、靈敏等優點，適用于米氮平的臨床藥動學研究和不良反應監測。

（致謝:本研究在河南省生物精神病學重點實驗室（新鄉醫學院）完成）

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