腺病毒介導HGF基因轉染對人脂肪干細胞生物學特性影響的研究

吳一杰 王黔 穆大力 欒杰

腺病毒介導HGF基因轉染對人脂肪干細胞生物學特性影響的研究

吳一杰 王黔 穆大力 欒杰

目的觀察腺病毒介導的HGF基因轉染對人脂肪干細胞（Human adipose-derived stem cells，hADSCs）生物學特性的影響。方法利用腺病毒介導HGF（MOI=200）轉染hADSCs，檢測轉染組細胞目的基因HGF表達情況，并與未轉染組細胞的形態、細胞生長曲線、細胞表面標志物、細胞周期和成脂、成骨誘導分化能力進行比較。結果hADSCs轉染24 h后，即可檢測出HGF，并于48 h后達到高峰，1周后HGF表達逐漸降低。hADSCs轉染后仍呈成纖維細胞樣生長，其生長增殖能力與未轉染hADSCs無明顯差別；轉染后的hADSCs仍表達CD44、CD90、CD49d、CD105，不表達CD45、CD34、CD31、CD106和STRO-1。轉染組與未轉染組細胞周期、成脂和成骨誘導分化能力無明顯差別。結論腺病毒表達載體介導HGF基因轉染hADSCs并不影響其生物學特性，是將hADSCs用于基因治療的良好途徑。

人脂肪干細胞 腺病毒表達載體 基因轉染 生物學特性

人脂肪干細胞 （Human adipose derived stem cells，hADSCs）是組織工程理想的種子細胞，由Zuk等[1]于2001年首次分離獲得。hADSCs具有來源豐富、易于獲取、自體移植可以避免排斥反應、可分化為多種中胚層來源細胞及跨胚層分化等優點[2-4]。研究證實，hADSCs在體外培養可以穩定增殖，在不同的誘導條件下，hADSCs可誘導分化為脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞等[5]。利用種子細胞作為基因治療的載體具有廣闊的應用前景，而hADSCs是外源性基因的最為有效的細胞載體之一，可使外源性基因在體內持續地發揮生物學作用。腺病毒轉染是調控基因、構建基因表達載體最有利的工具之一[6]，而腺病毒可以高效轉染hADSCs。肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）具有強大的促血管生長作用[7]，將HGF利用腺病毒轉染到hADSCs中并移植到受區，使HGF在受區持續發揮促血管生長作用，是再生醫學中具有廣闊應用前景的治療方式。但腺病毒介導HGF轉染對hADSCs生物學特性是否有影響尚不十分清楚，如果改變其生物學特性可能會對以后的實驗及臨床應用造成一定影響。因此，本研究擬針對Ad-HGF轉染的hADSCs與未經轉染的hADSCs的生物學特性進行比較。

1 材料

1.1 腺病毒

攜帶人肝細胞生長因子基因的腺病毒基因表達載體（Ad-HGF）和攜帶綠色熒光蛋白基因的腺病毒載體（Ad-GFP）由軍事醫學科學院放射醫學研究所實驗血液學實驗室饋贈。

1.2 人脂肪組織來源

脂肪來源于中國醫學科學院整形外科醫院吸脂患者。經知情同意，局麻下行腹部抽脂，獲取脂肪顆粒，生理鹽水充分洗滌，靜置約10 min，去除上清液，獲得純度較高的脂肪顆粒。

1.3 主要試劑

L-DMEM培養基、胎牛血清（HyClone公司）；Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、卡那霉素、青霉素、誘導培養基(Sigma公司)；ELISA檢測試劑盒 （R&D公司）；MTT (Amerison公司)；CD90、CD44、CD49d、CD105、CD34、CD31、CD45、CD106、STRO-1(Sigma公司)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養

取10 mL脂肪顆粒加入0.125%Ⅰ型膠原酶10 mL，37℃搖床250 r/min震蕩消化45 min，然后用等量含10%胎牛血清的L-DMEM中和膠原酶，1 300 g離心7 min，去上層未消化的脂肪組織及上清，加3 mL L-DMEM懸浮沉淀物，篩網過濾，再次離心，棄上清，加入10 mL含10%胎牛血清LDMEM重懸沉淀物，再次篩網過濾，接種至培養皿中。次日換液，之后每隔2 d換液，7 d后胰蛋白酶消化傳代。第2代hADSCs用于轉染、檢測以及誘導等。選擇L-DMEM，是因為L-DMEM更適合培養hADSCs，低糖可能更有利于維持hADSCs的多向分化潛能[8-9]。

2.2 腺病毒擴增純化及滴定

2.2.1 利用293細胞擴增腺病毒

將293細胞接種于150 mm平皿，擴增至60個平皿，待細胞生長至90%融合時進行病毒感染，感染48 h后細胞出現完全細胞病變效應時，收集細胞及少量上清液，液氮和室溫下反復凍融3次，使細胞破裂釋出病毒顆粒，2 500 r/min離心10 min，棄細胞碎片，收集上清液約10 mL，-80℃保存。

2.2.2 氯化銫密度梯度離心法純化病毒

依次將1.4 g/mL CsCL溶液 2.5 mL、1.2 g/mL CsCL溶液2.5 mL加入超速離心管中，將凍融后的待純化病毒加于CsCL梯度溶液之上。28 000 r/min 10℃離心2 h，1.4 g/mL CsCL溶液和1.2 g/mL CsCL溶液之間出現白色霧狀病毒帶，上層為缺陷病毒，下層為完整病毒，盡量吸取下層病毒，與 1.3 g/mL CsCL溶液5 mL混合，28 000 r/min 10℃離心16 h。吸取白色霧狀病毒帶，以1～2倍體積的PBS稀釋。以PBS為透析液于4℃透析病毒，每2 h更換一次透析液，共換5次。取出純化的病毒，加入滅菌甘油至終濃度為10%，分裝，-80℃凍存。

2.2.3 噬斑分析法滴定病毒滴度

病毒濃度梯度的配制：10-2～10-14，加入96孔板中，每個孔加100 μL對應濃度的病毒，對照組直接加100 μL培養基。培養10 d后，觀察各孔噬斑和CPE現象，確定病毒滴度。以最高濃度孔為全陽、最低濃度孔和對照孔為全陰的測定結果為有效結果。感染滴度（pfu/mL）＝平均噬斑數×稀釋倍數，根據公式計算病毒滴度為：2×1011pfu/mL。

2.3 篩選轉染濃度

將第2代細胞接種于24孔板中，等細胞生長至80%融合，Ad-GFP、Ad-HGF分別以 MOI為50、100、200、300、400、500、1 000轉染hADSCs。方法如下：吸棄孔內培養基，加入Ad-HGF、Ad-GFP的無血清L-DMEM培養基，37℃，5%CO2孵育2 h，期間搖勻2次，去除含病毒培養基，然后換成含10 mL 10%胎牛血清的L-DMEM繼續培養。每天用熒光顯微鏡觀察細胞狀態和GFP綠色熒光蛋白的表達情況。24 h、48 h收集Ad-HGF組細胞上清液之后，每隔48 h收集該組細胞上清液（-80℃凍存），持續至第10天。

2.4 細胞形態學觀察

將第2代hADSCs接種于6孔板中，分為對照組和轉染組，為了便于觀察單個細胞形態，待hADSCs長到60%融合時即可轉染，以MOI=200轉染2 h，更換含10%胎牛血清的L-DMEM，1 d后鏡下觀察細胞形態，連續觀察10 d。

2.5 繪制轉染組和對照組hADSCs生長曲線

將第2代hADSCs以1×105cells/mL的密度接種于96孔板，待貼壁轉染組轉染腺病毒2 h，換成含10%胎牛血清的L-DMEM，次日開始MTT測定。兩組各選3孔加入20 μL MTT，37℃孵育4 h，吸棄含MTT的培養基，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解，選擇490 nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

2.6 細胞表面標志物測定

將第1代hADSCs接種于6孔板中，待細胞80%融合，轉染3孔為實驗組，另3孔為對照組。

2.7 細胞周期測定

將第2代hADSCs接種于24孔板中，每組細胞接種6孔，共18孔。待細胞80%融合時，轉染9孔為實驗組，另9孔為對照組，流式細胞儀檢測，得出兩組細胞的G2/G1周期。

2.8 誘導成脂和誘導成骨

2.8.1 成骨誘導

第2代hADSCs接種至6孔板中，其中3孔分別為轉染后加入成骨誘導培養基的實驗組 （A組）、正常hADSCs加入誘導培養基的對照組 （B組），hADSCs加入普通全培養基的空白對照組（C組）。

成骨誘導培養基：0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μmol/L抗壞血酸、含10%胎牛血清的L-DMEM。加入誘導培養基后，每3 d換液，至第20天。

2.8.2 成脂誘導

第2代hADSCs接種至6孔板中，其中3孔分別為轉染后加入誘導成脂培養基的實驗組 （A組）、正常hADSCs加入誘導培養基的對照組 （B組）、hADSCs加入普通全培養基的空白對照組（C組）。

成脂誘導培養基：0.5 mol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松、10 μmol/L胰島素、200 μmol/L消炎痛、含10%胎牛血清的L-DMEM。

加入培養基后，每3 d換液，至第14天，進行油紅染色。

3 結果

3.1 轉染48 h后HGF表達量的測定

通過熒光顯微鏡觀察，Ad-GFP以MOI=100、 MOI=200、MOI=300時轉染效率均可達到90%以上；轉染組細胞上清液ELISA分析顯示，48 h時HGF表達量最高,Ad-HGF以MOI=200轉染時細胞HGF表達量最高（圖1）。

圖1 轉染48h后HGF表達量的測定

3.2 細胞形態

對照組和轉染組hADSCs在48 h時，細胞均呈成纖維細胞樣生長，細胞形態未見明顯差異（圖2）。

圖2 兩組細胞形態未見明顯差異

3.3 細胞生長曲線

轉染組與對照組細胞生長曲線相似，數值相差甚小，生長趨勢吻合（圖3）。

圖3 細胞生長曲線

3.4 細胞表面標志物：

流式細胞儀測定細胞表面標志物顯示，兩組細胞 CD44、CD90、CD49d、CD105均呈陽性表達，CD45、CD34、CD31、CD106和STRO-1均呈陰性表達（圖4）。

圖4 流式細胞儀檢測

3.5 細胞生長周期

經流式細胞儀檢測，轉染組和對照組G2/G1期細胞分別為（1.9548±0.0522）和（1.9756±0.0324），差別無統計學意義（P＞0.05）。

3.6 分化能力比較

3.6.1 誘導成骨

加入成骨誘導培養基A、B兩組均可明顯看到鈣結節，加入普通培養基的C組無明顯鈣結節形成（圖5）。A、B兩組的各3孔均取5個視野，以Image Pro Plus軟件進行分析，鈣結節面積占視野面積比例分別為：A組（44.1±3.8）%，B組（42.7±2.1）%，P＞0.05。

圖5 成骨誘導結果

3.6.2 誘導成脂

加入成脂誘導培養基的A、B兩組均可明顯看到脂滴，C組無明顯脂滴形成。A、B兩組各3孔均取5個視野，以Image Pro Plus軟件進行分析，脂滴面積占視野面積比例分別為：A組 （30.6±2.2）%，B組（32.4±1.3）%，P＞0.05。

4 討論

選擇理想的種子細胞是組織工程與基因治療的重要課題之一，利用細胞作為載體，使各種目的基因在體內有效持續表達，是目前最具有應用前景的基因治療手段。hADSCs作為一種擁有多項優勢的成體多能干細胞，受到廣泛關注。而重組利用腺病毒載體整合外源性基因具有安全性、高效性和穩定性，是目前基因工程中最常用的病毒載體。將具有強大促血管生成能力的HGF以腺病毒轉染到脂肪干細胞中再移植到體內，是解決移植脂肪成活問題極有前景的方式。采用人脂肪干細胞作為腺病毒表達載體是否對其生物學特性產生影響，目前研究甚少，因此該方面的研究將會為組織工程和基因治療提供重要的理論基礎。

本研究采用傳統的hADSCs分離培養方法，通過與未轉染的對照組比較，觀察轉染對于hADSCs生物學特性的影響。

首先通過對轉染率和基因表達率的雙重篩選，選取Ad-HGF轉染hADSCs的較佳濃度。一般認為，較低或過高的MOI都會對載體轉染的效率產生不利影響。Morizono等[10]報道，當MOI=100時，腺病毒對hADSCs的轉染效率可達到99%； Hiroyuki等[11]報道，當MOI=300時，腺病毒對hADSCs的轉染效率可達到95%。以往研究證實，過高濃度的腺病毒載體并不能提高轉染效率，反而會引發機體的免疫反應，并由于細胞凋亡而導致基因表達效果下降。我們通過熒光顯微鏡觀察，發現Ad-GFP以MOI= 100、MOI=200、MOI=300時轉染效率均可達到90%以上，轉染組細胞上清液ELISA分析，48 h時HGF表達量最高,Ad-HGF以MOI=200轉染時細胞HGF表達量最高。因此，從轉染率和基因表達量兩方面綜合考慮，MOI=200為Ad-HGF轉染hADSCs較佳的濃度。

細胞形態學方面，兩組hADSCs均為梭形和多角形，呈成纖維細胞樣生長，形態無明顯差異，與已往研究報道一致，表明Ad-HGF轉染對hADSCs形態并無明顯影響。

MTT法繪制細胞生長曲線，兩組生長趨勢一致,故Ad-HGF轉染并未影響hADSCs生長增殖能力。觀察到轉染組細胞數稍低于對照組，我們認為可能是腺病毒轉染本身會造成少量細胞死亡,故細胞數初始值即低于對照組。

細胞表面標志物的檢測，兩組CD44、CD90、CD49d、CD105均呈陽性表達，CD45、CD34、CD31、CD106和STRO-1均呈陰性表達，與已有文獻[12]。本實驗結果證實，我們所用的細胞的確為hADSCs，轉染并沒有造成細胞表面標志物的改變。

檢測細胞周期發現，兩組種G2/G1期細胞差異無統計學意義，證明Ad-HGF轉染對ADSC細胞周期沒有明顯影響。

分別成骨成脂誘導后，兩組細胞均可分化為成骨細胞和脂肪細胞（脂滴），證明轉染后的hADSCs仍然具有多向分化潛能。Image Pro Plus軟件分析結果顯示，兩組細胞在分化能力方面差別微小。

腺病毒轉染對hADSCs的生物學特性影響很小，hADSCs仍然保持了它的干細胞特性，為今后的進一步實驗奠定了基礎。

致謝 北京協和醫學院整形外科醫院實驗中心、整形八科和軍事醫學科學院二所三室對本實驗給予了支持和指導，在此一并表示感謝。

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Study on Biological Characteristics of Adipose Derived Stem Cells Transfected with HGF Gene by Adenovirus Vector

WU Yijie,WANG Qian,MU Dali,LUAN Jie.

Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100144,China.Corresponding Author:LUAN Jie.

Objective To investigate the effect of HGF transfection by adenovirus vector (Ad-HGF) on biological characteristics of human adipose derived stem cells(hADSCs).Methods hADSCs was transfected by Ad-HGF in MOI=200. The expression of HGF gene was detected by ELISA.The differences of biological characteristics such as cell morphology, growth curve,surface markers,cell cycle,differentiation potential between hADSCs transfected by HGF group and hADSCs group were observed.Results The expression of HGF was detected in supernatant 24 hours post transfection.The peak of it presented at 48 hours post transfection and sustained till 1 week after transfection. The hADSCs transfected by Ad-HGF grows as fibroblast-like style.There were no morphology and cell viability changes observed between transfected group and control group.Both two groups were shown to be positive for the expression of CD44,CD90,CD49d and CD105.On the other hand,expression of CD45,CD34,CD31,CD106 and STRO-1 were negative.There was no significant difference between two groups in cell cycle,adipogenic and osteogenic differentiation potential were observed. Conclusion The biological characteristics of hADSCs are not affected by adenovirus transfection. Adenovirus transfection is an ideal way to integrate HGF gene to hADSCs.

Human adipose derived stem cells; Adenovirus vector; Gene transfection; Biological characteristics

Q813.1+1

A

1673－0364（2010）06－0306－05

2010年9月6日，

2010年10月21日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.06.002

100144 北京 北京協和醫學院整形外科醫院。

欒杰。