免疫組化染色質量控制在乳腺組織切片中的應用

郭秀芳

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,發病率占全身性腫瘤的 7%～10%,在女性僅次于子宮癌,已成為威脅女性健康的主要病因。本病的發病與遺傳有關,絕經期前后的女性發病率較高,是一種通過發生在乳腺上皮組織嚴重影響女性身心健康,甚至危及生命的最常見的一種惡性腫瘤之一[1]。由于乳腺的主要成分是脂肪,易造成石蠟切片的不完整性,我們探索自己實驗室的工作條件,及各種抗體的實驗條件來控制標準化實驗流程,穩定乳腺石蠟切片及其免疫組化染色的質量報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 來自本院臨床近 2個月送檢的乳腺標本,醫用可調控 16寸高壓鍋,2 000 kW電爐。

1.2 要試劑 PBS液(pH值 7.4),第一抗體為兔抗人雌激素受體(ER),兔抗人孕激素受體(PR),兔抗人CerbB-2單克隆抗體,第二抗體為快捷免疫組化Elivision試劑盒,DAB試劑盒,均購自福建邁新公司。

1.3 組織切片的制片 乳腺標本經 10%中性甲醛充分固定后,取其中病變組織,經過梯度酒精充分脫水,二甲苯透明,58℃石蠟浸蠟,60℃石蠟包埋制成蠟塊,一次性刀片進行切片,切片厚度為 2～3μm,40℃水溫展片,水中可加適量的乙醇,因其有張力,使切片能充分展開,無折皺,用經 APES防脫片處理過的載玻片撈片。65℃溫箱烤片 1～4h。

1.4 免疫組化染色方法 切片烤片后梯度酒精脫蠟至水,蒸餾水洗,PBS液浸泡 2 min×3次,3%的 H2O2溶液浸 5～10min,以消除內源性過氧化物酶的活性,PBS浸泡 2m in×3次,高壓鍋內放 PBS液,加熱至沸騰,把切片置于耐高溫塑料切片架上放入鍋內,蓋上鍋蓋,扣上壓力閥,繼續加熱至噴氣,從噴氣開始計時 1～2m in,壓力鍋離開水源,冷卻至室溫,取出切片,我們用二步法使它不含生物素,可以避免由于生物素引起的非特異性背景染色,所以無需血清封閉內源性生物素,將修復后的切片用 PBS液洗 2次之后,滴加一抗工作液 37℃ 1 h,PBS液洗 2次后滴加二抗 37℃ 15～20m in,PBS液洗 3次后,DAB顯色,復染,封片。

2 結果

乳腺組織切片無收縮開裂,組織結構細胞形態清晰,乳腺癌細胞及各種炎癥細胞能清晰辨認,HE染色鮮艷,細胞核呈鮮明的藍色,細胞質被伊紅染成深淺不同的粉紅色,核仁呈紅色,對比度良好,免疫組化染色的結果為病變組織結構完整,無脫片現象,陽性與陰性對比明顯,陽性物質定位準確,背景干凈清晰[2],無非特異性著色,細胞結構與細胞輪廓完整清晰,染色結果穩定可靠,敏感性高,特異性強,ER、PR在乳腺組織切片中細胞核呈深褐色,CerbB-2在乳腺切片中細胞核呈藍色,細胞膜呈褐色,鏡下呈環狀表達。

3 討論

免疫組化由于其具有復雜性,在技術應用過程中存在不少問題,直接或間接的影響了病理診斷,應予以重視以下幾個方面,才能從總體上保證乳腺組織免疫組化染色的質量。

3.1 制作優質的石蠟切片是做好乳腺癌免疫組化染色的基礎,組織固定的好壞是制作免疫組化結果的關鍵因素。乙醇脫水盡可能從較低濃度起始,以免組織過度收縮常溫下二甲苯透明時間≤30min,不然組織變脆,制定嚴格按操作程序進行,否則是免疫組化產生假陽性[3]、假陰性或脫片的主要原因。

3.2 免疫組化切片的質量控制要求,免疫組化染色使用的玻片必須用飽和的重鉻酸鉀濃硫酸浸泡 3 d以上,撈出后用水來水徹底清洗干凈,再用 95%的乙醇過一遍,晾干后涂防脫片劑烘干備用,裱片時切片片膜不能留有氣泡,烤片時溫度過低、時間過短,則易脫片,溫度過高、時間過長則對抗原有破壞,烤片后專用二甲苯、乙醇脫蠟至水洗,脫蠟要徹底。我們曾采用水浴法等方法進行抗原修復,但效果不如高溫高壓抗原修復法理想[4]。另外高溫高壓加熱時間的長短很重要,從組織切片放入緩沖液到高壓鍋離開火源的總時間控制在3min內,時間過長,可能會使染色背景加深。PBS緩沖液不能重復使用,且容量必須保證所有切片都能浸泡到,整個染色過程不要讓切片干涸。顯色在鏡下控制,時間約 3～7min,在陽性明確的部位著黃色即終止顯色,此時顯色程度較佳,能有效地避免背景著色。蘇木素復染后要充分返藍,否則背景呈紫紅色。

3.3 增強特異性著色、降低非特異性染色是免疫組化的質量保證,抗體是免疫組織化學最核心的試劑,其質量直接影響免疫組織化學的結果判斷繼而影響診斷,由于乳腺癌組織中的淋巴細胞、脂肪細胞會產生非特異性染色,因此要選擇特異性強,效價高的一抗,新購進的抗體儲存在 4℃冰箱并進行預實驗,摸索出最佳實驗條件?？贵w最好購即用型,以免在稀釋過程中增加不必要的錯誤。防止失效的抗體進入實驗室,此外要選擇病變典型的做免疫組化染色對照,一定要每一批免疫組化均設有已知陽性對照和用 PBS代替一抗的空白對照。

3.4 免疫組織化學結果的判讀,結果的判斷免疫組化切片應是陽性標記強而非特異性染色淡或無,兩者形成鮮明的對比,陽性表達必須在細胞或組織特定的部位,細胞邊界清楚;每批染色都要有陽性對照、陰性對照和自身對照才能對染色結果作出正確判斷。判斷標準常根據陽性細胞的百分比或陽性細胞的染色深度來判斷,其顏色深淺反映抗原量的多少。免疫組化染色結果還要結合組織形態學判斷是真正的陽性染色而非其他著色。陽性反應分布總是有規律、局限、定位準確和一定形態特征的,如細胞膜著色呈圓形;典型的細胞核著色為均質狀,核仁和染色質呈顆粒狀著色。

3.5 免疫組織化學陽性庫的建立。為了保證陽性對照的可靠性,在日常工作中要收集各種抗原的陽性組織和陽性切片,逐步建立陽性對照切片庫及相應的電子檔案庫。如預期結果為陰性或病理形態診斷與免疫組化結果相反時,必須要有陽性對照才能作出正確的病理診斷,陽性對照能說明染色技術和陰性結果的可靠性,不是由于標本處理不當導致的抗原喪失、方法錯誤、技術不熟練等造成的假陰性。乳腺組織免疫組化染色步驟多、過程長、影響因素也多,因此只有在各個細節都認真對待,然后以常規的形式相對固定下來,才能確保其免疫組織化學結果的可靠性。

1 周麗梅,張斌.乳腺癌癌周浸潤的病理組織學觀察.臨床外科雜志,2002,10：244.

2 張銘,司少艷,韓瑞剛,等.免疫組化 SP法與 PicTureTM兩步法的比較.診斷病理學雜志,2004,11：58-59.

3 李向紅.醫學實驗室標準化的方向.中華病理學雜志,2004,33：591-592

4 王力,楊舉倫.高壓鍋水浴法修復組織抗原防脫片技術的應用.診斷病理學雜志,2002,9：161.