正交試驗(yàn)法優(yōu)選祖師麻熏洗液醇提取工藝

敖利

（重慶市中醫(yī)研究院，重慶 400013）

祖師麻熏洗液是由祖師麻、乳香、沒(méi)藥等14味中藥組成的中藥復(fù)方制劑，具有祛瘀止痛、祛風(fēng)除濕的功效，臨床上用于治療退行性骨關(guān)節(jié)病。根據(jù)處方中藥材所含有效成分的性質(zhì)，分別需要提取揮發(fā)油，或用水提取，或用乙醇提取，其中祖師麻、乳香、沒(méi)藥采用乙醇回流提取。筆者通過(guò)正交試驗(yàn)篩選，以祖師麻所含的主有效成分之一祖師麻甲素含量為考察指標(biāo)，用方差分析法進(jìn)行分析，優(yōu)選了祖師麻熏洗液乙醇提取工藝條件[1－2]。

1 儀器與試藥

UV－752型紫外分光光度儀（上海電子光學(xué)技術(shù)研究所）；HNS11－2型電熱恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；AZ－200型電子天平（天津Mettler公司）；PBQ－Ⅰ型薄層自動(dòng)鋪板儀（重慶南岸新力實(shí)驗(yàn)電器廠）；微量進(jìn)樣器（上海醫(yī)用激光設(shè)備廠）；KQ－250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL－16G型臺(tái)式高速離心機(jī)（上海醫(yī)用分析儀器廠）。薄層層析硅膠G（60型，中國(guó)青島海洋化工集團(tuán)公司）；祖師麻甲素對(duì)照品（瑞香素，批號(hào)為0900－200102，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；藥材購(gòu)自重慶市藥材公司；祖師麻、乳香、沒(méi)藥乙醇提取樣品（自制）；所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 祖師麻甲素含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱取在105℃干燥至恒重的祖師麻甲素對(duì)照品10.4mg，置10mL量瓶中，用95％乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得（質(zhì)量濃度為1.04mg/mL）。

2.1.2 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：精密吸取祖師麻甲素對(duì)照品溶液10，20，30，40，50μL，分別置10mL量瓶中，各加95％乙醇－0.1moL/L鹽酸（10∶1）至10mL刻度，于328 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度（A）。經(jīng)計(jì)算，回歸方程為 A=0.000 3+0.046 9C，r=0.999 95（n=5）。結(jié)果表明祖師麻甲素質(zhì)量濃度在1.04～5.20mg/mL范圍內(nèi)與吸光度的線性關(guān)系良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取祖師麻醇提工藝樣品溶液20μL，祖師麻甲素對(duì)照品溶液10μL，點(diǎn)于硅膠G板上，以甲苯－甲酸乙酯－甲酸（5∶4∶1）為展開(kāi)劑，上行展開(kāi)15 cm，顯色，定位，挖取祖師麻甲素斑點(diǎn)及空白斑點(diǎn)，加95％乙醇－0.1mol/L鹽酸（10∶1）超聲波洗脫10min/次× 4次，60℃水溫，每次離心1min（10 000 r/min），合并上清液，定容至10mL。于328 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每隔一段時(shí)間測(cè)定1次，共測(cè)定24h。結(jié)果表明在本試驗(yàn)條件下，祖師麻甲素在8h內(nèi)穩(wěn)定。

精密度試驗(yàn)：依法在同一硅膠G板上點(diǎn)5等量的同一供試品溶液，同時(shí)點(diǎn)對(duì)照品溶液10μL，依法操作，測(cè)定吸光度。結(jié)果的RSD=0.19％（n=5），表明方法精密度良好。

重現(xiàn)性試驗(yàn)：依法對(duì)同一批樣品進(jìn)行5次獨(dú)立測(cè)定。先薄層展開(kāi)，定位，挖取斑點(diǎn)，洗脫4次，10min/次，60℃水溫，離心，取上清液，定容至10mL，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果的 RSD=1.69％（n=5）。

加樣回收試驗(yàn)：取祖師麻醇提工藝樣品溶液6份，每份4mL，分別精密加入一定量的祖師麻甲素對(duì)照品，混勻。每份取20μL點(diǎn)樣，薄層展開(kāi)，定位，挖取斑點(diǎn)，用95％乙醇－0.1mol/L鹽酸洗脫4次，10min/次（60℃水溫），離心1min（10 000 r/min），取上清液，定容至10mL，測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.1.3 樣品含量測(cè)定

取各工藝樣品溶液，各點(diǎn)20μL于硅膠G－3‰ CMC－Na（0.4mm）薄層板上，以甲苯－甲酸乙酯－甲酸（5∶4∶1）為展開(kāi)劑，上行展開(kāi)15 cm，取出晾干，以氨氣顯色定位。待揮盡氨氣后，挖取祖師麻甲素斑點(diǎn)及空白，粉末裝入小試管中，各加1 mL 95％乙醇－0.1mol/L鹽酸（10∶1），超聲洗脫10min（60℃水浴），離心1min（10 000 r/min），上清液倒入10mL量瓶中。共洗脫4次，合并洗脫液，并定容至10mL，于328 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算祖師麻甲素含量。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2 工藝參數(shù)優(yōu)化

2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及因素水平選擇

祖師麻、乳香、沒(méi)藥采用乙醇回流提取，影響提取效果的主要因素有乙醇濃度（因素A）、乙醇用量（因素B）、提取時(shí)間（因素C）、提取次數(shù)（因素D），每個(gè)因素取3個(gè)水平，應(yīng)用L9（34）正交表安排正交試驗(yàn)，以祖師麻甲素含量為考察指標(biāo)。按處方比例取祖師麻30 g、乳香10 g、沒(méi)藥10 g，按正交試驗(yàn)號(hào)提取，藥液濾過(guò)，測(cè)定含量。正交試驗(yàn)因素水平表及結(jié)果見(jiàn)表2及表3。

表2 因素水平表

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果表

2.2.2 數(shù)據(jù)分析

方差分析見(jiàn)表4。由直觀分析可知，因素D的極差 R最大，是最有影響的因素，各因素選擇為A3B3C3D3。由方差分析可知，各因素對(duì)乙醇回流提取結(jié)果有不同程度影響，D＞A＞B＞C。因素D有顯著性差異，為主要影響因素，應(yīng)選D3。C因素影響最小。綜合考慮，各因素選擇為A1B2C1D3，即加4倍量50％乙醇，每次回流提取1h，共提取3次。

表4 方差分析表

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

由于優(yōu)選的工藝未包括在正交設(shè)計(jì)表的9項(xiàng)試驗(yàn)中，故對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。用同一批藥材，提取同樣質(zhì)量，分別按A3B3C3D3與A1B2C1D3進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果A3B3C3D3與A1B2C1D3所提得的祖師麻甲素含量分別是0.56％和0.55％，非常相近，從省時(shí)節(jié)能角度考慮，確定A1B2C1D3為乙醇提取最佳工藝，即加4倍量50％乙醇，回流提取1.0h，共提取3次。

3 討論

方中祖師麻、乳香、沒(méi)藥含有較多脂溶性成分，采用乙醇回流提取。祖師麻的主要有效成分有祖師麻甲素（瑞香素，Daphnetin，7， 8－二羥基香豆素）、祖師麻乙素（瑞香苷，Daphenin.7，8－二羥基香豆素－7－β－D－葡萄糖苷）、皂苷等。祖師麻甲素具有消炎、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用，是祖師麻止痛、抗風(fēng)濕的有效成分之一。乳香、沒(méi)藥含較多樹(shù)脂、樹(shù)膠等，若采用水煎煮，湯液會(huì)渾濁，采用乙醇提取，可增強(qiáng)療效[3－4]。

本試驗(yàn)中因素A、因素B、因素C均未顯示顯著性差異，但極差分析仍能反映其影響，說(shuō)明本試驗(yàn)所選擇的因素具有一定的合理性。

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1986：1 739.

[2]謝秀瓊.中藥新制劑開(kāi)發(fā)與應(yīng)用[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：136.

[3]管玉珠.祖師麻中瑞香素提取工藝比較[J].蘭州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，26（2）：9.

[4]崔秀君.產(chǎn)舒康顆粒提取工藝研究[J].中國(guó)藥業(yè)，2004，13（11）：47－48.