中藥補髓健腦方對帕金森小鼠模型行為學及腦內一氧化氮含量的影響

程為平,董升平,馬莉,趙吉諾,張洋

(黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院神經內科,哈爾濱 150040)

帕金森病(PD)又稱震顫麻痹,是一種多發于中老年人的慢性神經系統退行性疾病,病理特征為黑質細胞變性壞死,腦內神經遞質多巴胺的生成、代謝障礙[1-2],主要表現為震顫,肌肉僵直,運動活動-啟動困難和姿勢反射喪失等[3]。造成以多巴胺能系統與膽堿能系統為主的腦內多個神經遞質之間的不平衡。左旋多巴類制劑為治療 PD的主要藥物[4],但長期應用會導致療效遞減。為了探討中藥治療PD的療效和機制,我們采用 PD小鼠模型進行以下研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 健康 10～11周齡 C57BL/6雄性小鼠 60只,體質量(20±2)g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。室內常溫下配方料喂養,自由飲食水。

1.1.2 儀器 電熱恒溫水浴箱(RF-540型,江蘇);電動玻璃勻漿機(DY89-1型,寧波);分析振蕩器(FZQ-2型,江蘇);托盤式扭力天平(TN-100B型,上海);電動離心機(LD5-2型,北京);722光柵分光光度計(上海第二分析儀器廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模方法 采用腹腔注射 MPTP的方法制備 PD動物模型。將 60只小鼠隨機分為空白組、模型組、中藥組及美多巴組。模型組、中藥組和美多巴組給予 1-甲基 -4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)腹腔注射(0.03mg/g體質量),1次/d,連續 7 d制備PD小鼠模型;空白組給予 0.9%氯化鈉注射溶液腹腔注射。

1.2.2 治療方法 實驗第 8天開始,中藥組予補髓健腦方灌胃,0.1 ml/g(每毫升含有生藥量1.2mg),1次/d,連續 14 d;美多巴組給予美多巴懸濁液灌胃(0.12 mg/g體質量),1次 /d,連續 14 d;空白組和模型組給予等量 0.9%氯化鈉注射溶液腹腔注射。

1.2.3 行為學測試方法 各組小鼠于實驗前 5天每日進行 2次爬桿、懸掛行為訓練。分別于實驗前1天(首次注射 MPTP前 1天),第 7天(注射藥物后1小時),第 14天和第 21天上午 10:00(針刺后1 h)進行爬桿[5]和懸掛[6]實驗以檢測其肢體運動協調能力。

將一直徑為 2.5 cm的泡沫塑料小球固定于一根長 60 cm粗 1 cm的木桿頂端,木桿上纏 2層紗布以防打滑。將小鼠放到球頂,分別記錄小鼠爬完桿長的上半部分、下半部分及全長所需的時間。3 s內完成上述某一動作記 3分;6 s內完成記 2分;超過6 s記 1分 。

將小鼠雙前肢懸掛于一水平電線上,如小鼠用雙后肢抓住電線記 3分;僅用一只后肢抓住電線記 2分;兩只后肢均抓不住記 1分;小鼠跌落記為 0分。

1.2.4 腦內 NO含量的檢測 行為學測試后,將小鼠斷頭取腦,經視交叉處冠狀切開,向后取約 3 mm厚腦組織,用冰 0.9%氯化鈉注射溶液漂洗后,濾紙拭干,稱重后加入 9倍冷 0.9%氯化鈉注射溶液。電動勻漿機中研磨成 10%勻漿,以 1 000～2 000 r/min離心 10 m in,取上清液,再以 8 000～1 0000 r/min離心 15 min,取上清液,分別按 NO試劑盒說明檢測其含量。

1.3 統計學處理 應用 SPSS軟件,采用 t檢驗。

2 實驗結果

2.1 行為學實驗結果 實驗前一天觀察小鼠爬桿及懸掛行為,模型組、中藥組和美多巴組小鼠實驗評分分別與空白組相比,無差異(P＞0.05、P＞0.05、P＞0.05);實驗第 7天、第 14天和第 21天觀察模型組小鼠,其實驗評分明顯降低,分別與空白組相比差異顯著(P＜0.01、P＜0.05、P＜0.01),提示造模成功;實驗第 14天和第 21天中藥組和美多巴組小鼠實驗評分明顯升高,分別與模型組相比差異顯著(P＜0.05、P＜0.01),說明中藥對 PD小鼠有治療作用。實驗第 14天和第 21天中藥組與美多巴組小鼠懸掛實驗評分相比,無差異(P＞0.05、P＞0.05),見表 1,2。

表1 各組小鼠實驗前后爬桿實驗評分(±s,分)

表1 各組小鼠實驗前后爬桿實驗評分(±s,分)

注:與空白組比較,aP＜0.01,b P＜0.05;與模型組比較,c P＜0.05;與中藥組比較,d P＞0.05

組別 鼠數(只)實驗前 1天 第 7天 第 14天 第 21天空白組 15 6.50±1.15 6.67±1.21 6.61±0.98 6.56±0.96模型組 15 6.30±1.28 4.41±1.21a 5.24±1.20b 5.49±0.79b中藥組 15 6.71±1.13 4.78±0.21a 6.69±1.05c 6.82±1.20c美多巴組 15 6.79±1.24 4.67±0.21a 6.32±1.14cd 6.45±0.74cd

2.2 生化指標檢測 模型組小鼠腦內 NO含量(6.62±0.49μmol/gprot)明顯增多,與空白組(3.36±0.40μmol/gprot)相比差異有統計學意義(P＜0.01);中藥組(3.67±0.21μmol/gprot)與模型組相比,小鼠腦內NO含量明顯減少(P＜0.01);美多巴組(3.25±0.54μmol/gprot)與模型組相比,小鼠腦內 NO含量明顯減少(P＜0.01);中藥組和美多巴組相比,差異無統計學意義(P＞0.05)。

表2 各組小鼠實驗前后懸掛實驗評分(±s,分)

表2 各組小鼠實驗前后懸掛實驗評分(±s,分)

注:與空白組比較,aP＜0.01,c P＜0.05;與模型組比較,d P＜0.01,e P＜0.05;與中藥組比較,b P＞0.05

組別 鼠數(只)實驗前 1天 第 7天 第 14天 第 21天空白組 15 2.05±0.74 2.09±0.89 1.99±0.83 1.97±0.75模型組 15 1.84±0.96 0.81±0.13a 0.94±0.27c 0.95±0.12a中藥組 15 2.06±1.01 0.89±0.26a 2.01±0.34d 2.03±0.48d美多巴組 15 2.21±0.85 0.71±0.25ab 1.94±0.29eb 2.07±0.71db

3 討論

3.1 中藥對 PD模型動物行為學的影響 運動障礙是帕金森病患者的主要臨床表現,運動障礙往往同時伴隨運動協調能力降低及肌張力增高,包括運動不能、運動減少、運動遲緩。實驗中,我們采用爬竿和懸掛實驗檢測帕金森小鼠的運動和協調功能障礙。研究發現中藥能夠顯著縮短小鼠爬桿時間,增強小鼠附著能力,提示中藥能夠提高動物模型肢體運動和協調能力,推測其對 PD的癥狀具有改善作用。

3.2 中藥治療 PD的機制 帕金森病屬于中醫的顫證范疇[7],《醫學綱目》曰:“掉即顫振之謂也”并首先提出“顫振”曰“顫,搖也;振,動也”。古人對顫證病因觀察十分細致[8],本病屬于本虛標實之證,本虛在肝腎陰虛,氣血不足,髓海空虛。標實為風,火,痰,瘀,上犯清空,腦神失司。綜上,組天元沖劑:肝筋虧虛,虛風內動則顫,陰血不足,筋脈失榮則痙。本方由首烏、黃精、天麻、葛根、元胡、當歸和石斛等藥組成。其中天麻、葛根可熄風止痙[9];元胡與當歸相配行氣止痛;首烏與黃精相配可補髓榮筋,石斛可益智健腦。諸藥相伍共奏止顫熄風、活血開竅之功。

PD的主要病理改變為中腦黑質致密部多巴胺(DA)能神經元的進行性變性壞死,目前認為可能與自由基、氧化反應增強等因素有關,當自由基無法正常被清除而在機體內過度堆積后,就會引起脂質過氧化等一系列損害反應,導致氧化應激的發生[10]。NO也是一種自由基,其與超氧陰離子(O-2)結合形成氧化亞硝酸離子,后者可以使線粒體的呼吸功能受到抑制,并可能損傷 DA能神經元或分解成 OH-自由基,產生細胞毒性作用,使損傷進一步加重[11]。

本實驗表明,中藥補髓健腦方可以降低 PD小鼠模型腦內 NO含量,從而改善自由基的代謝,減少神經元的損傷和神經毒性,減少其凋亡、壞死,進而達到保護黑質內神經元,抗氧化應激等目的,緩解PD的進程。

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