microRNAs的臨床運用探討

郭建生，陳士偉

(1、空軍杭州航空醫學鑒定訓練中心，浙江 杭州 310007；2、長海醫院實驗診斷科，上海 200433)

1993 年Lee等[1]利用遺傳分析的方法在秀麗隱桿線蟲中發現第一個22個核苷酸的小分子非編碼RNA-lin-4開始，microRNA(miRNA)被帶入了研究領域，但直到最近幾年這類基因的多樣性和廣泛性才被揭示出來。一系列的研究表明，microRNA在機體正常發育、分化、生長及凋亡中發揮重要的作用，如胚胎發育、細胞生長和凋亡、血細胞分化、神經元的極性、胰島素分泌、大腦形態形成、心臟發生和脂肪代謝等，隨著研究的進展，對miRNA的研究從量的表象變化已經慢慢過渡到作用機制，進入了更深一步的研究。隨著檢測方法的進步，一個新的領域—循環miRNA也逐漸成為科研的熱點，成為潛在的檢測標志物和治療靶向點。miRNA與多種疾病的發生發展存在密切的關系，本文對此進行部分闡述。

1 miRNA概述

miRNA(miRNA)是一類有大約1923個核苷酸組成的非編碼小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，在細胞增殖、分化、凋亡、個體發育、病毒感染及腫瘤的發生發展等方面具有重要的生物學功能。它們由細胞核內基因組DNA轉錄成RNA，經過特異性核酸酶drosha第一次切割形成pre-microRNA，利用運輸蛋白-5到達胞漿后再經過Dicer酶的第二次切割而得到成熟miRNA，其通過RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)靶向到達 mRNA，與靶基因 3’端非翻譯區(3’UTR)完全或部分互補結合，導致靶mRNA翻譯抑制并參與RNA干擾反應，使相應基因表達水平下降[2]。miRNA與靶mRNA完全互補配對后，mRNA被降解，若miRNA與靶mRNA不完全互補，則起到封閉靶mRNA的作用，抑制其翻譯過程[3]。編碼miRNA的基因占全部預測基因的1～5%，每種miRNA可調控多種靶基因，一個靶基因可能受不同miRNA的調控，改變人類蛋白基因的表達，維持機體的功能[4]。

2 miRNA與疾病

2.1 miRNA與腫瘤

miRNA表達與腫瘤的相關性是最有吸引力的研究。提取腫瘤組織細胞的RNA，利用microarray分析發現多種腫瘤組織與周圍的正常組織相比較miRNA表達水平有不同程度的上調或下調，發生miRNA圖譜改變，這一現象初步肯定了腫瘤發生與miRNA表達之間具有一定的相關性。已經有大量文獻報道疾病中有關的組織或細胞miRNA圖譜發生變化，特別是腫瘤miRNA表達譜可以提示其組織來源，同時也證明miRNA表達譜有助于人類腫瘤的組織分型，而且miRNA表達譜在提示組織譜系方面比傳統的miRNA表達譜效果更好。此外，miRNA表達譜還可以為低分化腫瘤找到其組織來源[5]。

miRNA既可作為抑癌基因，下調原癌基因的活性，也可作為癌基因，下調抑癌基因的活性。Calin GA等[6]首次驗證了microRNA在某些類型的白血病和淋巴瘤中發生了功能障礙，其中miR-15和miR-16起著關鍵作用，這兩種miRNA通過抑制Bcl-2蛋白的表達調節細胞凋亡過程，Bcl-2蛋白主要通過作用于線粒體來實現其抑制凋亡的生物學活性，因此當miR-15和miR-16丟失或突變時，Bcl-2蛋白的表達量上調，細胞凋亡受阻，因而導致腫瘤發生。作為癌基因的miR-21，研究證明在膠質母細胞瘤中表達升高，同時乳腺癌樣品中表達也有增加，故認為miR-21可能在腫瘤發生中起到廣泛的作用。而人的肺癌細胞中瞬時的表達let-7，作為抑癌基因，可以抑制細胞的增殖，如果肺癌患者的let-7表達降低，患者預后更差，非小細胞肺癌患者的let-7表達水平越低，其預后越差，術后生存期越短。同時最近研究也發現miR-31抑制抑癌基因促進肺癌的發生，它作用的目標基因是抑癌基因Last2(large tumor suppressor 2)和Ppp2r2a(PP2A regulatory subunit B alpha isoform)，與它們結合后促進腫瘤的生成，抑制抑癌基因發揮抑癌作用，人工敲除miR-31，Lats2和Ppp2r2a表達明顯上升，肺癌病人和肺癌鼠的miR-31和目標mRNA的表達相反，充分證實了這個結論[7]。

2.2 miRNA與內分泌疾病

在我國內分泌疾病有很大的人群，從功能上說主要表現為兩種情況，一是功能亢進，二是功能減退，雖然發病緩慢，但對病人造成的痛苦不可小覷。miRNA的出現為內分泌疾病的診斷和治療帶來了新的思路和方法。從胰腺B細胞分泌、胰島素的作用等每個環節都有miRNA的參與，而且影響其它相關分子。對來自1型糖尿病和正常人的Treg細胞進行miRNA篩查，利用TaqMan arry分析發現與正常人相比1型糖尿病病人Treg細胞miR-510上升近100倍，而miR-342和miR-191下降為近2倍和3倍。雖然具體的作用機制還沒有明確，但圖譜的改變已經說明miRNA在1型糖尿病中的重要作用[8]。

雌激素受體(ERα)是配體激活的轉錄因子，由荷爾蒙、DNA、和轉錄活化因子幾個重要結合區域組成，miR-22與表達ERα的mRNA的3’端非翻譯區(UTR)結合強力抑制ERα產生，過表達的miR-21通過誘導mRNA的降解而使ERα產生減少使雌激素的作用減弱，因而可以從另一方面思考miR-21的過表達可以抑制雌激素依賴性乳腺癌細胞的生長[9]。MiR-18已經被證實作用于編碼ERα的基因ESR1，過表達MiR-18降低ERα水平但同時促進肝癌細胞 (HCC)的增殖，對女性肝癌病人來說miR-18的過表達阻礙了雌激素潛在的保護作用而促進了肝癌的發展[10]。

2.3 miRNA與自身免疫性疾病

已經證實miRNA在免疫調節和免疫細胞發育扮演了重要角色。到目前為止，已經揭示一群特異性的miRNA在免疫系統中發揮重要的調節作用。利用LPS對人monocytic THP-1細胞進行刺激發現miR-146、miR-155和miR-132上調，TNF-a和IL-1b可以誘導miR-146的表達。進一步的分析揭示這是NFkB依賴性的[11]。由IFN-b和多種TLR配體的作用，鼠巨噬細胞miR-155表達上升，這些說明miR-155參與細菌和病毒的先天性免疫。而LPS刺激鼠巨噬細胞會引起miR-125的下調，因此推斷miR-125可能作用于TNF-amRNA，在LPS誘導TNF-a產生時miR-155表達下調[12]。系統性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種自身免疫性疾病，產生多種自身物質的抗體包括染色質、核糖和磷脂等而且臨床表現多樣。Dai等利用microarry分析來自23名SLE患者和10名健康者的外周血單核細胞 (peripheral blood mononuclear cell，PBMC)miRNA的表達，結果得出7種 miRNAs(miR-196a，miR-17-5p，miR-409-3p，miR-141，miR-383，miR-112，and miR-184) 表達下調，9 種 miRNAs(miR-189，miR-61，miR-78，miR-21，miR-142-3p，miR-342，miR-299-3p，miR-198，andmiR-298)表達下調[13]。對狼瘡腎炎活檢組織的miRNA的圖譜分析也有改變，36種上調和30種下調[14]。這些資料表明對于SLE患者miRNA可作為潛在診斷標志物和疾病相關分析因子。

2.4 miRNA與其它

皮膚是人體分布最廣的器官，在表皮和毛囊中的一些miRNA的高表達是皮膚正常發育必不可少的，將鼠胚胎皮膚祖細胞Dicer敲除發現皮膚上皮不能產生成熟miRNA，毛胚芽進入表皮層而不是正常的到真皮層。正常毛囊分化關鍵信號分子(sonic hedgehog，Shh 和 Notch homolog 1，Notch1)的表達在出生后7d消失[15]。MiR-203與皮膚形成有關，胚胎發育至13.5～15.5d時，鼠基底層細胞相比基底細胞miR-203增高25倍，miR-203抑制p63的表達，p63是表皮細胞增殖和分化的重要因子[16]，在胚胎形成中p63基因啟動上皮形成，維持表皮基底層成熟角質細胞的增殖潛力。皮膚microRNA的改變會引起增殖、分化的錯誤信號，最終導致皮膚疾病的產生。

3 循環miRNA

3.1 循環miRNA的來源與檢測方法

對于循環miRNA的來源目前主要觀點有：循環RNA來自于凋亡或壞死的細胞，細胞的主動釋放，以及循環細胞的裂解.但對于特定循環miRNA的真實來源還存在許多未知的因素。研究表明，內源性的循環RNA分子具有良好的抗RNase降解能力，有較高的穩定性。雖然目前機制還不是很清楚，但并不影響對其的研究。為了驗證內源性miRNAs在血漿中的穩定性，Mitchell等[17]將血漿放置室溫24h或經過8次凍融對目的基因的量進行測試發現影響很小，沒有顯著差異，充分證實了miRNA在血漿中的穩定性，具備作為臨床檢測指標的條件之一。

目前對microRNA的檢測主要有兩種方法，一是利用microarray芯片，對基因進行篩查，二是利用real-time PCR對目的基因進行相對定量檢測，有Taqman探針和SYBgreen法，Taqman探針因其具有特異、敏感和快速優于SYBgreen法而逐步成為實驗方法的金標準。由于在血清中miRNA的含量少且其分子量小，因而在進行樣本抽提時不同于普通的RNA抽提。利用mirVana PARIS試劑盒，用等體積酸性酚-氯仿抽提樣品以去除蛋白成分，通過不同梯度100%乙醇的加入達到對不同RNA成分的分離最終獲得高濃度的miRNA洗脫液用于下面的逆轉錄和定量檢測。

3.2 循環miRNA是檢測的潛在標志物

與組織表達的miRNA一樣，循環miRNAs首先最廣泛地用于對腫瘤疾病的研究。在血清中檢測腫瘤組織中高表達miRNA并對其分析來判斷miRNA對疾病診斷、治療、預后的檢測作用。循環miR-1可作為急性心肌梗死 (acutemyocardial infraction，AMI)的潛在標記物，與正常組比較AMI在疾病組的Ct值中值有明顯的差別(CtI=32.11，AMI=28.35)，利用ROC 曲線(receiver–operator characteristic curve，ROC)分析來肯定它的診斷價值，并且回歸分析miR-1的水平與年齡、性別、高血壓、糖尿病等與AMI有關的因素都無相關[18]。miRNA還可用來對懷孕不同時段的監測，與未孕對照組比較孕期第一階段(6～12周)和孕期第三階段(34～41周)let-7d、miR-527、miR-520d5p、miR-526a、miR-141 的表達隨著孕齡增加而增高，對胎兒發育起到監測的作用[19]。

4 展望

通過miRNA檢測達到對疾病的檢測、治療和預后的檢測已經是目前關于RNA研究的熱點，miRNA的表達有高度保守性、時序性和組織特異性，而且在血清或血漿中通過實驗方法可以檢測量的表達變化。雖然大部分miRNA的功能和作用機制還沒有完全清楚，但其在維持機體健康和疾病監控的作用越來越受到關注。目前蛋白水平檢測是在轉錄翻譯后，而miRNA則通過影響轉錄后翻譯達到調控，對疾病的臨床意義更大，并且就當前的技術可以很快地建立起miRNA為系統的檢測方法，以miRNA為新的檢測標志物的建立是可以期盼的。

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