脂肪源干細胞的特性及其在骨科組織修復中的應用

黃德清,馮燕茹

(天津市第三醫院骨科,天津 300250)

多年來,對于成體干細胞的研究多集中在骨髓來源的間充質干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BSCs)。但骨髓來源有限,抽取時有一定的并發癥,所得干細胞數量少[1,2]。近年來,脂肪組織來源的干細胞(adipose tissue derived mesenchymal stem cells,ASCs)引起了人們越來越多的關注。ASCs是一種中胚層來源的細胞,最早從抽脂術中抽取的脂肪組織懸液中分離培養,并證實為多能干細胞;在適當的誘導條件下能向軟骨細胞、成骨細胞、肌肉細胞、神經細胞以及上皮細胞等定向分化,因而,其在骨科組織修復中的作用日益受到人們的重視 ,相關研究日見增多[2～4]。

1 脂肪干細胞的分離及培養

ASC的培養和分化方法均借鑒了以往 BSC的研究方法。通常采用經典培養液加 10%～20%的胎牛血清對 ASC進行培養擴增[2～4]。常用的方法是將剪碎的脂肪組織消化離心,傾去上層脂肪及上清,獲得基質血管層,將其收集到培養瓶中培養,除去未貼壁的紅細胞和殘渣,貼壁的細胞生長至融合后傳代,傳代后的細胞稱為 ASCs。剛貼壁的 ASCs呈圓形、紡錘形或梭形,細胞核居中,可出現雙核或多核。傳代后圓球形細胞減少,大部分為紡錘形或梭形。隨著傳代次數增加,細胞形態、排列趨于一致。在分化能力上,ASCs可以分化成各種中胚層來源的細胞系,如脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、神經細胞及內皮細胞等,而這些細胞系也正是BSCs的分化方向[2,5]。

2 脂肪干細胞特征性表面標記物的表達

ASCs在形態上與 BSCs相似,因此無法從形態學上對兩者加以鑒別。同時,ASC與 BSC還具有相似的分化表型[2,3,5]。有文獻分析比較了 BSC與 ASC的表面標記物,發現兩種細胞均能夠表達 CD29、CD44、CD105、CD49b和CD49e,均不能夠表達 CD31、CD34、CD45、HLA-DR和CD133;但二者在表型上也有差別,ASC表達 CD49 d,肯定不表達 CD106,而 BSC正相反,肯定表達 CD106,而不表達CD49 d。研究發現,細胞存在的微環境及細胞具體功能會影響其免疫表型的表達,如 CD106在 BSC和造血干細胞的相互作用中起重要作用,而 ASCs中 CD106的陰性表達則與其處于非造血組織的特點相一致[2,3]。

3 脂肪干細胞在骨科組織修復中的應用

3.1 促進軟骨修復 ASC在成軟骨培養基(chondrogenic medium,CM)中可以定向分化為軟骨細胞[6～9]。CM中通常添加轉化生長因子-β、地塞米松和抗壞血酸。成軟骨分化成功的標志是典型基因的表達和軟骨細胞外基質蛋白的出現,如 Sox-9、Ⅱ型膠原、可聚蛋白多糖、雙糖鏈蛋白多糖、核心蛋白聚糖、硫酸軟骨素和軟骨低聚基質蛋白。 Winter等[8]用CM同時培養 ASCs和 BSCs,結果表明兩者都能向軟骨方向分化,阿爾新蘭染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色均呈陽性,但培養 2周以后發現 ASCs不如 BSCs分化的完全。有學者將ASCs進行高密度培養,用 CM誘導后植入纖維蛋白膠支架,用其修復軟骨缺損,組織學檢查結果表明再生組織為透明軟骨。另一項研究在小鼠體內制備骨、軟骨缺損的模型,并植入ASCs進行修復,結果骨、軟骨缺損均成功修復,并且 ASC修復的骨、軟骨缺損的效果優于自體骨、軟骨移植,而且在每個隨訪檢查點,ASCs植入組的軟骨修復參數 Pineda評分都高于自體軟骨移植[2]。

3.2 促進骨骼修復 用于誘導成骨分化的培養基中添加有維生素 C、地塞米松、β-磷酸甘油,這些化學物質被認為是誘導干細胞向成骨細胞分化的定向誘導基,被稱為成骨培養基(osteogenic medium,OM)[10～12]。 ASCs在 OM中誘導后可出現成骨分化,可見磷酸鈣礦化的細胞外基質、骨鈣素、堿性磷酸酶、骨橋蛋白、I型膠原和成骨轉錄因子基因,如 Runx2和 OSX的表達。ASCs在 OM中體外誘導培養后第 7天,這些細胞開始分泌出島狀的細胞外基質;2周后堿性磷酸酶染色陽性并形成礦化結節;第 2～4周,培養孔中鈣化的細胞外基質的量明顯增加。 ASCs向成骨細胞分化的能力可以維持相當長的時間,其表達堿性磷酸酶的活性可達培養后的175 d。將小鼠 ASC在 OM中培養幾代后,細胞表面形成突起,形態類似于體內的成骨細胞,茜素紅染色呈陽性。研究人員進一步將此種誘導所得的小鼠 ASC作為種子細胞植入聚羥基乙酸支架中,再移植到小鼠體內,經過 4～8周時間,通過免疫組化分析,可以觀察到植入部位成骨過程的發生。經成骨誘導的 ASC植入聚乳酸支架修復大鼠顱骨缺損,與對照組相比,有更多的骨組織形成[11]。研究發現,轉染骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BM P-2)基因的ASCs更易分化成成骨細胞,并可更快啟動細胞外基質的鈣化。在大鼠體內制作后外側脊柱融合模型,將 BM P-2轉染后的 ASCs植入Ⅰ型膠原支架上,再移植到大鼠脊柱需融合部位,成功實現了脊柱融合[12]。有學者在臨床上用自體 ASC與髂骨及纖維蛋白膠等結合,修復 1例 7歲女孩的大面積顱骨缺損,術后 3個月,CT掃描顯示原顱骨缺損基本愈合。說明臨床上使用自體 ASC是安全的,而且能促進大面積、難治性骨缺損的修復[13]。

3.3 促進椎間盤修復 因為椎間盤源性下腰痛發病率高,用干細胞修復退變的椎間盤引起了人們很大的興趣[14,15]。有作者將兔腹股溝部來源的 ASCs單獨與椎間盤髓核或纖維環共同培養,結果表明,與其他培養條件相比,與髓核一起培養的 ASCsⅡ型膠原和核心蛋白聚糖基因表達增加。這表明髓核細胞釋放的可溶性因子可引導 ASCs向髓核樣細胞分化。自體 ASCs無論用生長因子誘導,以及黏附于基質材料上與否,注射入椎間盤組織后,均顯示其有促進椎間盤組織修復的作用。有作者將 ASC在體外用綠色熒光基因轉染后,植入大鼠的腰椎間隙內,用無損傷活體成像系統成功檢測到熒光基因的表達,術后 7d時表達達高峰,14 d后開始減弱,ASCs在椎間隙內存活達 28d以上[15]。

3.4 促進肌腱修復 ASCs在適當的條件下可分化為肌腱細胞,植入肌腱損傷處可明顯促進肌腱愈合[2,16,17]。有作者用膠原酶制作馬的肌腱損傷模型,然后在肌腱損傷周圍注入自體 ASCs治療,ASCs治療肌腱組的生物力學測試及組織學檢查結果均優于對照組,軟骨寡聚基質蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COM P)基因表達增加。COM P結合到復合膠原纖維上,可促進膠原的形成和成熟[16]。 Huang等[17]將 ASCs用攜帶綠色熒光基因的腺病毒轉染后,植入大鼠跟腱缺損處,術后 0～28 d用活體無損傷成像系統在跟腱修復處檢測到綠色熒光的表達;術后 28 d,修復段跟腱標本的冰凍切片用免疫熒光標記的第二抗體進行染色,熒光顯微鏡下,在肌腱修復段檢測到大量熒光標記的 ASCs,表明ASCs可用于肌腱損傷的修復。

[1] Liu TM,Martina M,Hutmacher DW,et al.Identification of common pathways mediating differentiation of bone marrow and adipose tissue-derived human mesenchymal stem cells into three mesenchymal lineages[J].Stem Cells,2007,25(6)：750-760.

[2] Mizuno H.Adipose-derived stem cells fot tissue repair and regeneration：10 years of research and a literature review[J].J Nippon Med Sch,2009,76(2)：56-66.

[3] MitchellJB,McIntosh K,ZvonicS,etal.Immunophenotypeofhuman adipose-derived cells：Temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers[J].Stem Cells,2006,24(3)：376-385.

[4] Zuk PA,Zhu M,Mizuno H,et al.Multi-lineage cells from human adipose tissue：Implications for cellbased therapies[J].Tissue Eng,2001,7(2)：211-228.

[5] Rubin JP,Bennett JM,Doctor JS,et al.Collagenous microbeads as a scaffold for tissue engineering with adipose-derived stem cells[J].Plast Reconstr Surg, 2007,120(4)：414-424.

[6] Feng G,Wan Y,Balian G,et al.Adenovirus-mediated expression of growth and differentiation factor-5promotes chondrogenesis of adiposestem cell[J]. Growth Factors,2008,26(3)：132-142.

[7] Hennig T,Lorenz H,Thiel A,et al.Reduced chondrogenic potential of adipose tissue derived stromal cells correlates with an altered TGFbeta receptor and BM P profile and is overcome by BM P-6[J].J Cell Physiol,2007,211(6)：682-691.

[8] Winter A,Breit S,Parsch D,et al.Cartilage-like gene expression in differentiated human stem cell spheroids：A comparison of bone marrow-derived and adipose tissue-derived stromal cells[J].Arithritis Rheum,2003,48(6)：418-429.

[9] Dragoo JL,Carlson G,McCormick F,et al.Healing full-thickness cartilage defects using adipose-derived stem cells[J].Tissue Eng,2007, 13(12)：1615-1621.

[10] Shen FH,Zeng Q,Lu Q,et al.Osteogenic differentiation of adipose-derived stromal cells treated with GDF-5 cultured on a new tree-dimensional sintered microsphere matrix[J].Spine J,2006,6(6)：615-623.

[11] Yoon E,Dhar S,Chun DE,et al.In vivo osteogenic potential of human adipose-derived stem cells/poly lactide-co-glycolic acid constructs for bone regeneration in a rat critical-sized calvarial defect model[J]. Tissue Eng,2007,13(50：619-627.

[12] Hsu W K,Wang JC,Liu NQ,et al.Stem cells from human fat as cellular delivery vehicles in an athymic rat posterolateral spine fusion model[J].J Bone Joint Surg(Am),2008,90(9)：1043-1052.

[13] Lendeckel S,Jodicke A,Christonphis P,et al.Autologous stem cells(adipose)and fibrin glue used to treat widespread traumatic calvarial defects：Case report[J].J Craniomaxillofac Surg,2004,32(3)：370-373.

[14] Lu ZF,Zandieh DB,Wuisman PI,et al.Influence of collagen typeⅡ and nucleus pulposus cells on aggregation and differentiation of adipose tissue-derived stem cells[J].J Cell Mol Med,2007,11(11)：1582-4934.

[15] Leo BM,Li X,Balian G,et al.In vivo bioluminescent imaging of virus-mediated gene transfer and transduced cell transplantation in the intervertebral disc [J].Spine,2004,29(8)：838-844.

[16] Richardson LE,Dudhia J,Clegg PD,et al.Stem cells in veterinary medicine-attempts at regenerating equine tendon after injury[J].Trends Biotechnol, 2007,25(4)：409-416.

[17] Huang D,Chhabra A,Balian G.Tendon tissue engineering and gene transfer：the future of surgical treatment[J].J Hand Surg,2006,31(5)：693-702.