RNA干擾及其在乳腺癌研究中進展*

遼寧醫學院附屬第一醫院普外科(錦州 121001)

朱 培 綜述 趙樹鵬△ 審校

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是由雙鏈 RNA引發的序列特異性基因沉默現象[1],可高效、特異地沉默特定基因。RNA干擾提出時間并不長,但這項技術已應用于多個領域,并取得了突飛猛進的發展。隨著研究的不斷深入,RNAi在基因功能研究尤其是腫瘤相關基因研究及腫瘤治療中的應用方面將有著巨大應用價值。

1 RNAi的發現和發展

1990年,Jorgensen及Mol領導的研究組在矮牽牛屬植物中通過添加過量的合成色素的基因拷貝,來增加花瓣紫色的著色。結果不但紫色沒有加深,而且一些轉基因的花出現白色或全白色。這說明不僅導入的基因未被表達,反而連植物本身的某些合成色素的基因也失活,他們稱此現象為共同抑制(cosuppression)[2]。1998年,Fire和Mello等證實 Gou發現的正義 RNA或反義 RNA誘導基因表達抑制是由體外轉錄制備的RNA中污染了微量的ds RNA而引起,首次提出了RNA干擾學說。同年Richard等同樣向果蠅的合胞體中注入對應4個基因的雙鏈 RNA,結果得到了相應基因功能缺失型的表型。這個結果表明 RNA干擾機制不是線蟲特有的,很可能廣泛存在于不同的生物中。2001年Sayda等[3]用長度為21～25bp的雙鏈RNA在哺乳動物細胞中誘發基因特異性沉默由此證實 RNA干擾機制是生物界一種古老且進化上高度保守的現象。

2 RNAi的機制

在正常生物體內,細胞內的雙鏈 RNA(ds RNA,38個堿基以上)在依賴ATP的情況下,被核糖核酸酶Dicer切割成雙鏈小干擾RNA(siRNA,19～23個堿基)。siRNA這個結構對基因沉默效應有著決定作用。(1)siRNA中有兩條鏈,一條為正義鏈,一條為反義鏈,其中反義鏈可與多種核酸酶結合形成沉默復合物(RISC)[4],同時由于反義鏈與某一種 m RNA的編碼區是同源的,因此可與此編碼區互補結合,隨之引導 RISC結合m RNA,然后通過依賴于ATP的解螺旋酶解開 siRNA的雙鏈,并將其正義鏈與靶 m RNA置換,即 m RNA取代正義鏈與反義鏈互補,繼而核酸酶將mRNA切割成21～23 nt的小片段,切斷部位大約在與siRNA反義鏈配對序列的中部,于是 mRNA發生降解,從而導致基因表達的沉默,干擾了靶基因的表達。(2)RISC中的Rd RP(RNA依賴性 RNA聚合酶)以 siRNA反義鏈作為引物,以靶 m RNA為模板合成新的dsRNA,然后由 Dicer切割產生新的siRNA,新 siRNA再去識別新一組 m RNA,又產生新siRNA。經過若干次合成-切割循環,沉默信號就會不斷放大,甚至穿過細胞界限,在不同細胞間長距離傳遞和維持。RNAi的特異效應作用是在轉錄水平、轉錄后水平、翻譯水平等多個不同的水平上實現的。其中以 siRNA(short interfering RNA)轉錄后水平的RNAi研究最為深入,應用最為廣泛。

3 RNAi的特征

(1)特異性:RNAi是轉錄后水平的基因沉默機制,有高度的序列特異性。RNAi介導的降解作用的最終調節者是21-mer siRNA,是由dsRNA的核糖核酸酶Ⅲ分裂產生的。退火的21-mer RNA鏈通過轉染引入到細胞中,在細胞內與細胞相關m RNA特異地結合,活化一個RNA降解過程,導致相應的蛋白水平減低 80%～90%。這種高度的序列特異性使dsRNA能夠非常特異地誘導與之序列同源的m RNA降解,與其他基因無關。(2)高效性:RNA由于循環放大效應,在低于反義核酸幾個數量級的濃度下,就能使目標基因的表達降到極低水平甚至完全抑制,從而產生缺失突變體表型。(3)傳播性:RNAi抑制基因表達的效應可以穿過細胞膜,在不同的細胞間長距離傳遞并維持信號,甚至傳播至整個有機體。(4)高穩定性:siRNA分子是3'端有突出的非配對堿基的雙鏈分子,在細胞內可穩定存在 3～4d,半衰期長于反義寡核苷酸。(5)三磷酸腺苷(ATP)依賴性:在去除ATP的樣品中RNAi現象降低或消失,顯示RNAi是一個ATP依賴的過程。

4 siRNA的合成方法與途徑

(1)化學合成:設計出 siRNA序列后,由合成儀按照序列進行合成及后續的純化。(2)體外轉錄:針對siRNA的序列合成對應的DNA鏈,再利用 RNA聚合酶進行體外轉錄,轉錄產物即可導入細胞。(3)siRNA表達框:本質是一段含有能表達siRNA分子的PCR產物,無需克隆入載體即可導入細胞抑制特定基因的表達。(4)siRNA表達載體:是將 siRNA對應的DNA雙鏈序列克隆入載體內,位于RNA聚合酶Ⅲ的啟動子后,在體內表達所需的siRNA分子。使 siRNA直接在體內得到表達,可用于RNAi長期研究。(5)“雞尾酒”法(RNasem酶切 dsRNA):其過程如下,首先針對靶基因的mRNA在體外轉錄合成長dsRNA;再用 RNasem或 Dicer對長ds RNA進行酶解,形成一組siRNAs的混合物;最后將該混合物導入細胞內。

5 RNAi在乳腺癌中的體外研究

5.1 乳腺癌的侵襲與轉移相關基因的RNAi Gu等[5]通過構建針對人 VEGF-C基因的siRNA表達載體,利用 RNA干擾技術沉默V EGF-C基因,VEGF-C基因及蛋白水平表達量明顯降低,COX-2和Bcl-2的表達減弱,細胞體外活性下降,72 h后凋亡率達 60%,乳腺癌細胞 MDA-MB-435的凋亡明顯增加。趙矯[6]構建人端粒酶逆轉錄酶(h TERT)基因的RNA干擾表達載體,并轉染致 MCF-7細胞內,結果以 DNA質粒為載體的siRNA能有效抑制h TERT基因的表達,進而抑制乳腺癌M CF-7細胞生長、促進細胞凋亡。Liu等人設計兩對針對 C35編碼區的si RNA,并合成構建到轉錄載體pTZU6+1上,形成重組質粒siRNA-C35,在脂質體介導下轉染乳腺癌細胞株 T47D,結果顯示,質粒 p TZU6+1、psh RNA-C35-1和psh RNA-C35-2組的相對表達率分別是脂質體對照組的95.3%、40.0%和28.4%。siRNA轉錄載體轉染乳腺癌細胞株能有效抑制乳腺癌細胞中C35基因的表達。Ma等[7]構建 FAK基因 siRNA的重組質粒FAK-siRNA,在脂質體的介導下轉染入人乳腺癌M CF-7細胞,成功轉染 FAK-siRNA后乳腺癌 MCF-7細胞 FAK基因的表達與陰性對照組、空白質粒轉染組相比 FAK m RNA和蛋白表達水平明顯降低,細胞增殖指數及侵襲力明顯降低。Huang[8]通過siRNA抑制 MDA-M B-453細胞中 AP-2α的表達,下調乳腺癌細胞 MDA-MB-453中 HER2 m RNA及其蛋白的表達,抑制 le了MDA-MB-453細胞的生長,提示 AP-2α基因在乳腺癌細胞的發生、發展中具有重要作用,AP-2α可能是 HER2過量表達乳腺癌的治療靶點。Guo[9]體外化學合成 AnnexinⅡ基因序列特異性雙鏈小干擾 RNA(AnnexinⅡ-siRNA),并轉染致高轉移人乳腺癌細胞株 MDA-MB-231中,AnnexinⅡ-siRNA能有效抑制 AnnexinⅡ mRNA和蛋白表達,經 si RNA處理的細胞,細胞生長速度明顯降低,侵襲遷移力顯著下降。孫梅成功構建siRNA-MK表達質粒,并有效沉默 MK基因的表達。沉默M K基因后,通過對基質金屬蛋白酶(MM P-2和MMP-26)的影響,降低腫瘤細胞和基質之間的粘附性、腫瘤細胞的遷移能力和腫瘤細胞的侵襲性,從而降低腫瘤的侵襲和轉移。

5.2 RNAi用于抑制乳腺癌細胞耐藥基因的表達Jia[10],通過 shRNA-BCAR1抑制乳腺癌細胞 BCAR1基因的表達,BCAR1基因在 m RNA水平和蛋白水平表達均明顯抑制。BCAR1表達被抑制后,癌細胞對抗雌激素藥物 TAM的耐藥性明顯降低。Tang[11]構建干擾乳腺癌細胞 BCRPm RNA的腺病毒載體,采用細胞毒性實驗和外排實驗檢測 p Ad-BCRP感染后,顯示 Ad-BCRP可將 B37/MX細胞對米托蒽醌的耐藥指數從 978降低至75(92.3%逆轉)。感染 p Ad-BCRP和未感染的B37/MX細胞外排1 h后細胞內的米托蒽醌的熒光強度分別為56.4和12.8。從而證實p Ad-BCRP能顯著降低乳腺癌 B37/MX細胞中BCRP的表達并抑制BCRP的功能。Li[12]利用 RNA干擾技術,選擇耐阿霉素人乳腺癌細胞 M CF-7/ADR及其敏感細胞系MCF-7作為研究對象。將預先設計的siRNA包裝入質粒載體,然后轉化質粒到大腸桿菌中,經過克隆、擴增、純化后轉染到細胞中沉默基因 mdr1,顯示 MCF-7/ADR細胞經特異性siRNA作用后,P-gp的表達率由 99%下降到 12.3%,阿霉素耐藥實驗顯示,轉染 siRNA的MCF-7/ADR細胞 IC50為0.51umol/L而未轉染組的IC50為17.88 umol/L從而為siRNA作為一種可能的治療手段提供了理論依據。

5.3 乳腺癌的細胞周期調控 魏欽俊通過構建靶向DNMTI基因的短發夾狀 RNA重組質粒,從 mRNA水平來抑制 DNM TI基因的表達,解除乳腺癌發生相關基因啟動子區的高度甲基化,抑制乳腺癌細胞的異常增殖或逆轉乳腺細胞的惡性轉變,證實重組質粒 p GCsi-T2、p GCsi-T3對乳腺癌 Mc F一 7細胞中 DNM TI基因的轉錄均有明顯的抑制作用,抑制率分別為64.2%和74.7%。McF-7細胞轉染后,p GCsi一 T3重組質粒明顯抑制乳腺癌 M CF一 7細胞的增殖;大量細胞發生凋亡;細胞周期分析可見 S期明顯減少,而 Gl/GO期細胞顯著增加。張寧在乳腺癌組織及癌旁組織中檢測到moesin基因在高表達,利用 RNA技術,通過慢病毒介導沉默乳腺癌細胞moesin基因后,降低 Rho A、Racl基因表達,下調 cyclinDl基因,抑制細胞 Gl期-S期轉換;通過下調 p-gP蛋白表達水平影響 MCF-7/ADR耐藥能力,使細胞不再適應原有培養環境,出現細胞增殖抑制和凋亡改變;通過下調 CD44v 6、MMP一 7蛋白表達水平,上調 E-cadherin蛋白表達水平影響細胞侵襲轉移能力。張海雁[13]用脂質體介導法將 p BBS212-h TR(反義端粒酶 RNA真核表達載體)導入人乳腺癌細胞 M CF-7中,端粒酶反義 RNA能顯著抑制 MCF-7細胞的端粒酶活性,調節細胞周期,抑制MCF-7細胞的增殖并誘導其凋亡。

5.4 RNAi與腫瘤細胞信號轉導 通過病毒載體介導的RNA,沉默乳腺癌細胞 HGF受體 c-Met的表達,阻斷 HGF-c-Met信號傳導通路,抑制乳腺癌細胞增殖、誘導細胞凋亡。

6 RNAi在乳腺癌中的體內研究 Wu[14],構建 S100A4基因特異性 sh RNA表達載體,經過脂質體介導將 S100A4-shRNA表達載體轉染入MCF-7細胞,建立乳腺癌裸鼠移植瘤模型后并進一步注入裸鼠移植瘤內。所構建的S100A4-sh RNA表達載體轉染 MCF-7細胞 48 h后,能有效抑 S100A4的表達,并且顯著降低 MCF-7細胞增殖水平,以及誘導細胞進入晚期凋亡。穩定轉染 S100A 4-sh RNA表達載體的MCF-7細胞形態無顯著變化,但其侵襲力和遷移力明顯下降;裸鼠體內成瘤實驗也顯示實驗組裸鼠移植瘤的體積和質量明顯小于空白對照組和陰性對照組。Wang[15]應用化學修飾的小干擾 RNA(siRNA)沉默人裸鼠乳癌移植瘤新生血管中的血管內皮生長因子受體-1(V EGFR-1)基因,抑制血管生成進而抑制腫瘤的生長,移植瘤增長趨勢受到明顯抑制。Li應用化學修飾的小干擾RNA(siRNA)阻斷裸鼠乳癌移植瘤中血管內皮生長因子 C(V EGF-C)基因,VEGF-CsiRNA處理組瘤組織的增長受到明顯抑制,V EGF-C基因的m RNA和蛋白表達水平顯著降低,抑制腫瘤的生長。Huang[16],構建 PI3K基因 siRNA質粒Psilencer1.0-U6-PI3K-siRNA,建立人乳腺癌裸鼠移植瘤動物模型,應用 siRNA沉默磷酸肌醇-3-激酶(phosphatidy linositol-3 kinase,PI3K)基因,腫瘤內 PI3K基因表達水平明顯下降,Fox O3a基因的表達水平明顯升高,腫瘤生長抑制,裸鼠的生存時間延長。Smith等[17]使用載體介導的RNAi轉入四期人乳腺癌的高度轉移的裸鼠動物模型,特異性抑制了CX CR4基因表達。接種親本細胞的裸鼠腫瘤發生自發性轉移,并最終死亡,而所有接種靶向 CXCR4基因的si RNA表達載體細胞的裸鼠肉眼觀察無轉移形成,且部分裸鼠無腫瘤形成。證明抑制 CXCR4基因可以提高原發性和轉移性乳腺癌病人的治療效果。

7 應用前景與問題 RNA干擾現象的發現為腫瘤基因治療開辟了一條新道路,RNA干擾在生命科學領域的研究將是腫瘤生物學研究的熱點和前沿,而且有著廣泛的前景。RNAi技術已經日漸成為乳腺癌基因治療中令人關注的研究熱點。RNAi技術可以高效、特異的抑制多種與乳腺癌發生發展和耐藥相關的基因表達,為乳腺癌的有效治療提供新的方法。特別是 RNA干擾在乳腺癌細胞體內研究的日漸成熟為乳腺癌基因治療用于臨床提供了可能。但是李媛雖然成功構建針對人ER81m RNA序列 si RNA表達載體 p Genesil1-ETV 1A/ETV 1B/ETViC-siRNA,沉默乳腺癌 MDA一 MB一 231細胞ER8l基因,抑制了ER81m RNA的轉錄與蛋白的表達,但是并不促進乳腺癌細胞凋亡。可見乳腺癌的發生是多基因共同作用的結果,單純抑制某種基因意義不大。目前關于RNA干擾多基因的實驗研究面臨諸多技術難題,鮮有報道。盡管乳腺癌細胞體內研究有了很大進步,但是關于RNAi的體內應用的安全性研究十分不足,所以 RNAi的腫瘤基因治療應用于臨床仍然十分遙遠。

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