水稻基因組序列研究進展

王瑞云，王計平，李潤植

（山西農業大學農學院，山西太谷030801）

糧食短缺是全球21世紀面臨的最嚴峻問題之一[1]。水稻、小麥和玉米是最重要的3種糧食作物，其中水稻在亞洲的消費和種植超過90%，養活著占全球60%的亞洲人口。30多億亞洲人需要的能量有35%～75%來源于水稻。每年水稻的種植面積達0.103億hm2，占全球耕地的11%[2]。然而，由于水稻消費國人口的迅速增加，估計到2030年水稻產量需再增加40%才能滿足需求[2]。生物技術和傳統育種的有機結合是高產穩產的保障，而高產穩產則依賴于有特征明顯的水稻基因組序列。因此，解譯其基因組是對水稻和其他禾谷類作物進行應用和基礎研究的先決條件。

1 水稻基因組測序計劃

基因組包含了生物的進化、遺傳和生命的奧秘，是細胞遺傳物質的總和，其大小通常以全部DNA堿基對總數來表示。水稻基因組有12條染色體，其中染色體1最長，染色體10最短，核基因組序列總長約389Mb[3]。迄今，水稻全基因組測序工作已經完成，其覆蓋度為95%。并且有6條染色體[4-9]和2個著絲粒[10-12]已完全測序。

國際水稻基因組測序計劃（IRGSP）于1998年正式啟動，由來自10個國家的測序小組共同完成水稻2個亞種粳稻和秈稻基因組的測序工作。已完成的序列誤差率低于1/10 000（精度99.99%），即1萬個核苷酸中測定錯誤的核苷酸少于1個。以往存在的分歧得到解決，圖距再度縮短。該成果使遺傳學家能夠根據特征鑒定一些基因，并且發現了以前未知的較大區段重復，該區段重復占全基因組的60%[13-15]。

2002年12月，水稻12條染色體的堿基測序工作完成（提前3年）。日本在其中發揮著主導作用，并最先以99.99%的精度完成了最長的第1條染色體的測序工作。隨后，中國、美國、中國臺灣、印度和法國分別完成了染色體4，10，5，11和12全長序列的精確測定。

2 物理圖譜、序列測定和覆蓋度

IRGSP運用BAC和PAC 2個克隆系，采用克隆連克隆測定法（clone by clone sequencing）測定了日本晴的染色體序列。該策略運用的材料包括：高密度遺傳圖譜、表達序列標簽、YAC和BAC物理圖譜、BAC末端序列和2個草圖序列[16-23]。對3 401個的BAC/PAC克隆系測序到約為10倍的序列覆蓋度，并將該克隆系裝配，完成序列的堿基錯誤率小于1/10 000。運用一系列底物（包括PCR片段、10 kb的質粒、40 kb的fosmid克隆系），在BAC/PAC的tiling通道中，橋接了物理缺口染色體的大部分。在12條染色體上仍有62個缺口染色體（包括9個著絲粒缺口染色體和17個端粒缺口染色體）未測序。已經測量了染色體臂和端粒缺口染色體，在CentO衛星DNA含量的基礎上估測了9個著絲粒缺口染色體。估計其余的缺口染色體全長為18.1Mb[3]。

已經在GenBank/DDBJ/EMBL的PLN分區定位了97%的BAC/PAC和缺口染色體序列。上述序列和其他的草圖序列克隆系組成水稻12條染色體上的假分子。這些假分子的核苷酸序列全長為370 733 456 bp，具有一個長為6.9Mb的N-average連續序列。通過比較來自不同實驗室長為1.2Mb的重疊序列可以估測特征序列，總精確度達99.99%。

基于錨定BAC重疊群長度和缺口染色體大小的推定值，日本晴基因組具有403Mb的單倍體核DNA[24]。將推定的缺口染色體長度加到全部未重疊序列中，水稻核基因組的總長達388.8Mb。因此，在全基因組中假分子約占95.3%，在常染色質中假分子約占98.9%。通過尋找單一表達序列標簽標記得到了通過假分子來體現基因組覆蓋度的獨立衡量尺度[19]。在假分子的8 440個表達序列標簽中，有8 391個（99.4%）被鑒定。

染色體1的預測長度達51.4Mb，約占水稻堿基總數的1/10[5]。迄今，已完成了大約43.3Mb的測序工作（精度99.99%），其中短臂序列長為493 729 bp，約6 756個基因，其中約30%的基因（2 073個）已被功能分類。基因大小的均值是6.4 kb。染色體1富含G+C，特別是在編碼區具有幾個分散或串聯重復序列基因簇分布的特征。

染色體4的預測長度達36.8Mb[6]，已經以99.99%的精度完成了大約34.6Mb的測序工作。著絲點長達1 116Mb，是目前已知序列植物中最長的。共預測到4 658個基因和70個tRNA編碼基因，其中1 681個基因與EST相匹配。35%的基因功能已被分類。G+C含量達44.16%。轉座子明顯偏向常染色質域。染色體5的預測序列長為42.2Mb，其中包括29.8Mb的非重疊序列[8]。運用日本晴基因組的指紋重疊群數據，通過整合280個BAC/PAC克隆序列和232個STS/EST標記，構建了依賴于BAC和PAC克隆的日本晴的精細物理圖譜。該圖譜包括5個重疊群，覆蓋估測染色體（30.08Mb）的99%。4個物理間隙估測分別是1～3缺口為30 kb、第4缺口為20 kb。該圖譜有利于對水稻功能基因組進行定位克隆和更多特征的研究。

染色體10的預測長度達23.7Mb[7]，已經以99.99%的精度完成了大約22 422 563 bp的測序工作，短臂和長臂分別為7.6，14.8Mb。共預測到3 471個基因和67個tRNA編碼基因，其中81.3%的基因與EST相匹配。已經對51.4%的基因的功能進行了分類。G+C含量達43.5%。這些序列貯存在美國的DNA公共數據庫中，記錄代碼為AE016959。染色體11和12的預測序列總長為55.9Mb，占基因組全長的14.3%[4]。鑒定了5 993個非轉座元件相關基因，其中包括289個類抗病基因和28個防御響應基因，這遠遠高于其他染色體上類抗病基因的含量。

2007年，全基因組SwaI光學限制性（酶切）圖譜被構建，該物理圖譜的全基因組大小為382.17Mb，圖距比以往縮短了11%，包括覆蓋12條染色體的14個重疊群，位于除染色體6，9和11以外的9條染色體上的9個重疊群不存在缺口[25]。

3 著絲點定位

典型真核細胞的著絲點含有重復序列，該重復序列包括CentO衛星DNA和側翼逆轉錄轉座子和轉座子。水稻的全部著絲點都含有高度重復的155～165 bp的CentO衛星DNA序列和著絲點-特異性逆轉錄轉座子[26-27]。染色體4和8分別含有59 kb和69 kb的CentO重復序列簇[10-12]，CentO重復序列簇呈從頭到尾的串聯排列。已經找到介于CentO重復間和CentO重復周圍的大量的逆轉錄轉座子，包括著絲點-特異性逆轉錄轉座子RIRE7。CentO重復序列簇顯示了2條染色體在長度和取向方面存在差異。

對假分子進行BLASTN分析，結果顯示，約0.9Mb的CentO重復序列簇被測序，并且這些重復序列簇與著絲點-特異性逆轉錄轉座子有關。全部的CentO序列位點都與已鑒定的與遺傳有關的著絲點區相似。在染色體4，5，8的著絲點區遍布假分子，而在其他染色體上假分子僅存在于著絲點區的某些部位[3]。

熒光原位雜交證實染色體5上與端粒和著絲粒區相應的BAC克隆在粗線期的染色體上。54.6 cM的著絲點區覆蓋著一個沒有物理缺口的跨度為2.1Mb的最小tiling通道。運用3個重疊的BAC/PAC約150 kb揭示了著絲點的精確位置。另外，FISH結果顯示，粗線期著絲點區的染色質濃度不均一[8]。

4 串聯重復序列和簡單序列重復

禾本科植物中許多激素應答蛋白和防御蛋白家族（幾丁質酶、病原相關蛋白、種子過敏原等）屬于串聯重復序列[3]。在水稻的基因組中，串聯重復序列占14%。水稻染色體10上有2個基因家族，即具有27個拷貝的編碼富含甘氨酸蛋白的基因家族和具有48個拷貝的編碼TRAF/BTB域蛋白的基因家族[28]。每隔5Mb檢測串聯排列的基因，發現水稻的153個基因列陣含有10 134個成員，65%的具有27個以上成員的串聯列陣和33%的具有10個以上成員的列陣中含有蛋白激酶域[3]。盡管水稻染色體11和染色體12的長度和基因總數相似，但是染色體12上所含的類抗病基因不到染色體11的1/2。染色體11和12間類抗病基因數量的差異影響其串聯基因序列的長度，各有924個和684個（分別占染色體11和12基因總量的29%和24%），基因在較短的遺傳距離上至少重復一次[4]。

水稻基因組Ι型簡單序列重復是多于20個核苷酸的完全序列重復，而重復序列若多于20個核苷酸則被看作高變異度區，這可以為遺傳育種提供豐富的標記[3，29]。已經鑒定了代表47個明顯的基序家族的水稻基因組Ι型SSR 18 828個，該序列已注釋在水稻基因組中；提供了應用較廣的RFLP及已經公布的SSR相關的基因組Ι型SSR物理圖譜位置的有關信息[16，29-30]。高變異度的SSR平均每Mb為51個，其中，最高的分布在染色體3上，為55.8個SSR/Mb；最低的分布在染色體4上，為41個SSR/Mb。成千上萬的SSR在一系列不同的栽培種中顯示出擴增性好、多態性高的特點，這樣便可很快將其用于基因分析[3，29]。

5 結語

水稻基因組序列圖譜的完成和準確定位是引人注目的，如今已經擁有了水稻全部染色體的藍圖。目前，已經獲得基因、重復序列和著絲粒等主要組成元件的分布和定位[3]，近41 000個水稻基因的功能已經被搞清楚[31]，絕大部分的圖譜序列已經被公布在公共數據庫中。基于該序列上獲得的暫時的水稻假分子為科學界估測基因組提供了契機。而且，已有的SNP和SSR方面的信息將促進分子標記輔助育種和定位克隆，加速水稻改良的進程，進而為全人類的食物安全提供保障。

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