微生物發酵法替代肉制品中亞硝酸鹽呈色作用的研究進展

李沛軍，孔保華*，鄭冬梅

(東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

微生物發酵法替代肉制品中亞硝酸鹽呈色作用的研究進展

李沛軍，孔保華*，鄭冬梅

(東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

亞硝酸鹽在食品中的重要作用之一是促進肉制品產生粉紅色澤，但由于其潛在的致癌性，使其應用受到限制。本文對目前研究的各種微生物在替代亞硝酸鹽發色中的作用進行綜述，對其發色機理進行討論，并對微生物發酵法替代亞硝酸鹽的未來發展趨勢作出預測。

乳酸菌；亞硝酸鹽替代；亞硝基肌紅蛋白；肉制品

Abstract：One of the most important roles of nitrite in food industry is to improve the pink color of cured meat products.However, the use of nitrite is limited due to its potential carcinogenicity. In this paper, the alternation of microbial fermentation to nitrite addition for colorizing cured meat products has been reviewed and related mechanisms have been discussed. Moreover,the development trend of this alternation has been predicted.

Key words：lactic acid bacteria (LAB)；alternatives to nitrite addition；nitrosomyoglobin；cured meat products

肉的顏色是衡量肉和肉制品質量的最主要指標[1]，腌肉的粉紅色澤更是消費者選擇產品的重要標準。亞硝酸鈉是目前肉品腌制的關鍵組分，其在肉制品中的作用主要有：抑制肉毒梭狀芽孢桿菌的生長和毒素的形成，延緩食品腐敗，阻止微生物的生長[2]，抗氧化[3]，產生腌肉的特征風味，以及與肌紅蛋白作用，產生穩定的紅色澤[4]。其中，亞硝酸鹽的發色作用是其在肉制品中使用的主要原因之一。

然而，在肉中亞硝酸鹽可以與仲胺類物質反應，生成N-亞硝基化合物[5]，這種物質具有致癌性、致畸性，特別與腦瘤和胃腸道癌變密切相關[6-7]。因此，引發了大量替代亞硝酸鹽的研究。各種物質替代亞硝酸鹽的研究報道已屢見不鮮，而微生物發酵法替代亞硝酸鹽是一個較新的研究領域，我國在此方面研究較少。國外目前研究主要是在發色方面[8]，某些乳酸菌和其他微生物可在不添加亞硝酸鹽的條件下，轉化高鐵肌紅蛋白產生具有紅色澤的肌紅蛋白衍生物。

1 亞硝酸鹽呈色作用及其替代物研究狀況

肉的顏色取決于血紅素蛋白的兩種化合物，即血紅蛋白和肌紅蛋白及其存在形態。肌紅蛋白為肉自身的色素蛋白，肉色的深淺與其含量多少有關。血紅蛋白存在于血液中，對肉顏色的影響要視放血情況而定。放血良好的肉，肌肉中肌紅蛋白色素占80%～90%，比血紅蛋白豐富的多[9]。

亞硝酸鹽作為一種很強的血紅素氧化劑，首先和肌紅蛋白反應，將肉由紫紅色的肌紅蛋白轉化為棕色的高鐵肌紅蛋白。在還原條件下，隨著時間推移，顏色會轉化為亮紅色的亞硝基肌紅蛋白(NO-Mb)。而熱變性會使其轉化為亞硝基血色原(dinitrosyi ferrohemochrome，DNFH)，即NO-亞鐵血色原，為穩定的粉紅色[7]。

腌肉中使用硝酸鹽或亞硝酸鹽可能會引起一系列安全問題，歸納起來包括自身化學毒性，在食品中或食用后生成致癌物，以及危害動物生殖和發育等方面，在現行腌制肉中允許使用的硝酸鹽或亞硝酸鹽水平下，不會出現上述問題[10]。但由于亞硝酸鹽作為潛在有毒物質，而且也發生過很多將其誤作為其他成分用于食品或飲料中的事件，所以應控制好肉制品中亞硝酸鹽的使用限量，避免中毒風險。

由于亞硝酸鹽在食品中的重要作用和潛在危害，目前亞硝酸鹽替代物研究較多，且部分成果已應用于實踐或生產[11]。其中用于腌肉發色的亞硝酸鹽替代物主要有：紅曲色素[12]、番茄汁[13]、甜菜紅[14]、山梨酸鹽[15]、亞硝基血紅蛋白[16]和胭脂樹紅[17]等。目前研究最多且已用于生產的是紅曲色素，但自從法國學者在紅曲霉的培養物中檢測出一種對人體有害的真菌毒素(桔霉素)后[18]，引發了人們對紅曲色素安全性的懷疑。因此，未來紅曲色素的使用可能也將面臨挑戰。基于此，人們迫切需要一種新的方法來替代肉制品中的亞硝酸鹽進行發色作用。

2 微生物發酵法替代亞硝酸鹽發色研究進展

自從1993年日本人Arihara等[19]對1550株天然環境分離菌株和347株乳酸菌在培養基中轉化高鐵肌紅蛋白(metmyoglobin，Met-Mb)的能力進行研究后，微生物發酵法替代亞硝酸鹽發色的研究從未中斷。目前已確定的菌株主要集中在以下幾類。

2.1 乳酸菌發酵替代亞硝酸鹽的研究

乳酸菌由于其在食品中的廣泛應用而受到重點關注。研究表明，很多乳酸菌具有轉化高鐵肌紅蛋白的能力。

2.1.1 發酵乳桿菌

發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)屬于腸道內的正常菌群，多用于非洲谷物類食品的發酵和豆豉的生產[20]，是食品工業應用較多的乳酸菌之一。發酵乳桿菌JCM1173可在deMann-Rogosa-Sharp(MRS)液體培養基中將棕色的高鐵肌紅蛋白轉化為亮紅色的肌紅蛋白衍生物[19]，該衍生物光譜吸收帶——α和β吸收帶，分別位于577nm和544nm，且從中提取出的血紅素部分的可見吸收光譜與NO-血紅素相似，據此推斷，得到的亮紅色物質正是形成典型腌肉色澤的色素物質——亞硝基肌紅蛋白(nitrosylmyoglobin，NO-Mb)。由于培養基中并未直接添加亞硝酸鹽或硝酸鹽，所以參與形成該色素物質的NO并非源于亞硝酸鹽的降解，而是源于發酵乳桿菌自身的代謝作用。

此后，Morita等[21]將同位素標記的L-精氨酸作為MRS培養基氮源，發現在含有高鐵肌紅蛋白的培養基中，實驗的10株發酵乳桿菌均可將高鐵肌紅蛋白轉化為亞硝基肌紅蛋白，且菌株發酵乳桿菌IFO 3956活性最強。同位素標記結果表明，發酵乳桿菌IFO 3956正是利用了L-精氨酸合成了亞硝基肌紅蛋白生成所需的關鍵物質——NO。Morita等由此得出結論，該菌體內可能含有NO合成酶(NOS)，但并未對此進行系統的研究。

此后，Zhang等[23]再次將發酵乳桿菌AS1.1880(JCM 1173)應用于哈爾濱紅腸的生產中，以部分替代腌制中使用的亞硝酸鹽。當發酵乳桿菌制成的發酵劑接種量為108CFU/g時，香腸即可產生與亞硝酸鹽腌制肉相當的色澤，光譜掃描分析表明這種紅色素正是亞硝基肌紅蛋白。并指出，盡管發酵乳桿菌AS1.1880可能成為香腸生產中亞硝酸鹽的替代品，但是發酵乳桿菌和少量亞硝酸鹽的搭配使用可能更具有效力。這樣可以有效預防發酵乳桿菌的變異，從而保證產品的成功。

2.1.2 植物乳桿菌

植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)是乳酸桿菌的一種，多數從植物中分離得到，故得名，是食品發酵工業常用的菌種之一。土耳其人等[24]對從植物青貯飼料，混合青貯飼料和腌制黃瓜中分離出的細菌產NO的能力進行了研究。結果表明，5株植物乳桿菌具有產NO的能力，可將含有高鐵肌紅蛋白的MRS瓊脂培養基變為紅色，將高鐵肌紅蛋白轉化為亞硝基肌紅蛋白，但是他并沒有在450～650nm掃描波長范圍內觀察到它的特征吸收峰。而此前對于植物乳桿菌的研究，植物乳桿菌JCM 1149[19]、LP1和DSM9843(LP2)[25]，均未測定出其具有轉化高鐵肌紅蛋白的能力。這也說明了不同菌種，甚或是同一菌種的不同菌株，其產NO的能力均存在差異。

2.1.3 明串珠菌和片球菌

2.2 葡萄球菌發酵替代亞硝酸鹽的研究

葡萄球菌廣泛存在于傳統肉制品中，它們在發酵肉制品中的主要作用是其硝酸鹽還原酶活性，產生蛋白酶和脂酶，分解蛋白質和脂類，以及產生特殊的風味[26]。基于其在肉制品中的重要應用，很多研究者都把葡萄球菌列入了研究對象。

Morita等[27]對葡萄球菌替代亞硝酸鹽發色進行了廣泛而深入的研究。由肉塊中分離的肉葡萄菌(Staphylcoccus carnosus)和溶酪葡萄球菌(Staphylococcus caseolyticus)，在培養基和肉基質中均可將高鐵肌紅蛋白轉化為紅色肌紅蛋白衍生物；Mller等[22]在實驗中將商用發酵劑——肉葡萄球菌XⅢ轉化產生的這種紅色衍生物進行了光譜掃描分析和電子自旋共振(electron spin-resonance，ESR)測定，結果證明這種肌紅蛋白衍生物為氧合肌紅蛋白；而從帕爾馬(Parma)火腿中分離出的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、瓦氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)和緩慢葡萄球菌(Staphylococcus lentus)均可在Parma火腿中將高鐵肌紅蛋白轉化為紅色的肌紅蛋白衍生物。ESR結果顯示，這種紅色衍生物不是已知的基態肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白、高鐵肌紅蛋白和亞硝基肌紅蛋白中的任何一種，而是一種新的肌紅蛋白衍生物。

Morita等[28]將木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)FAX-1用于MRS培養基和意大利臘腸(Salami)中進行實驗，結果表明，該菌株可在pH5.8的培養基中將高鐵肌紅蛋白轉化為六配位NO的肌紅蛋白配合物，而在較低pH值條件下則生成五配位的亞硝基肌紅蛋白(NO-Mb)，且這種轉化隨pH值變化是可逆的；而在意大利臘腸中則只形成了五配位的亞硝基肌紅蛋白，這種五配位的NO-Mb正是亞硝酸鹽腌肉呈特征紅色的物質。這與Mller等[22]研究的結果類似，發酵乳桿菌在MRS液體培養基中生成的和在發酵臘腸中生成的兩種肌紅蛋白衍生物，ESR光譜信號存在差異，這可能是由兩種基質pH值的不同引起的，由于肌紅蛋白殘留相鄰組氨酸的質子化作用，可能會導致NO-Mb的配位數由6個變為5個。

2.3 其他菌株

Faustman等[29]報道，在4℃牛肉糜中接種熒光標記假單胞菌(Pseudomonassp.)，高鐵肌紅蛋白水平下降，牛肉糜的顏色由棕轉紅。此外，細菌培養液在體外有效降低了高鐵肌紅蛋白濃度。根據這些推斷源自細菌細胞的細菌代謝產物或胞內組分應是高鐵肌紅蛋白轉化的原因，但對紅色素提取物還沒有進行最終確定。最新研究表明：莓實假單胞菌(Pseudomonas fragi)可將牛肉中高鐵肌紅蛋白轉化成還原態的去氧肌紅蛋白，從而使牛肉呈紅色澤[30]。考慮到假單胞菌常常是導致肉品腐敗的優勢菌[31]，因此如何利用假單胞菌發酵替代亞硝酸鹽發色尚需進一步的研究。盡管如此，對其的研究工作已經對闡明微生物發酵肉制品的發色機理做出了貢獻[30]。

Arihara等[19]研究了從天然環境中分離出的菌株在Trypto-Soya培養基中轉化高鐵肌紅蛋白的能力，結果表明，庫特菌(Kurthiasp. K-22)、青紫色素桿菌(Chromobacterium violaceumK-28)，可將高鐵肌紅蛋白轉化為紅色的肌紅蛋白衍生物，光譜掃描分析表明，這種衍生物是氧合肌紅蛋白。

3 微生物替代亞硝酸鹽的呈色機理

微生物發酵法的呈色機理是將棕色的高鐵肌紅蛋白轉化成了肌紅蛋白的其他紅色衍生物，包括氧合肌紅蛋白、去氧肌紅蛋白、亞硝基肌紅蛋白和其他未知的肌紅蛋白等。

3.1 氧合肌紅蛋白和去氧肌紅蛋白形成機理

商用發酵劑菌株戊糖片球菌PC-1和肉樣葡萄球菌XⅢ，庫特菌K-22和青紫色素桿菌K-28均將高鐵肌紅蛋白轉化成了氧合肌紅蛋白。究其原因，細菌對肉品顏色的作用一直歸咎于細菌的氧化呼吸作用和肉表面的氧分壓作用。理論上說，初期細菌消耗氧氣，不同程度降低了氧分壓，這就導致了高鐵肌紅蛋白的形成；而進一步的氧氣消耗使得氧分壓很低，促使高鐵肌紅蛋白降解[19]。這些細菌對肉表面和培養基中氧氣的消耗很可能是氧合肌紅蛋白生成的原因。而Motoyama等[30]的研究表明，莓實假單胞菌對肉的發色作用是由于其在牛肉表面形成了一層“生物被膜”，從而阻斷了氧氣進入肉中，加上細菌本身的消耗，極大降低了肉表面氧氣的濃度，從而使得高鐵肌紅蛋白在極低的氧分壓下轉化生成紅色的去氧肌紅蛋白，使肉由棕色還原成紅色。

3.2 亞硝基肌紅蛋白形成機理

亞硝基肌紅蛋白是由一氧化氮和肌紅蛋白配位結合形成的，所以一氧化氮的來源問題便是亞硝基肌紅蛋白形成的根本問題。對于一氧化氮的來源，研究者們也作了大量的研究工作，但至今未達成共識。

Morita等[21]利用同位素標記，發現發酵乳桿菌IFO 3956正是利用L-精氨酸合成了NO，說明該菌體內可能含有NO合成酶。而Xu等[25]對此進行了否定，他認為，Morita等[21]的實驗并未直接對NO的生成進行測定，且沒有進行NO合成酶抑制實驗，而他忽視了細菌體內還存在一種L-精氨酸降解酶(ADI)，它可將L-精氨酸轉化為NH4+，再通過細菌的硝化作用，進一步氧化為總氧化氮(TON)，因此該實驗并不能得出發酵乳桿菌IFO3956體內含有NO合成酶的結論；他認為NO是源于MRS培養基中微量硝酸鹽的降解。近來等[24]在10株可轉化高鐵肌紅蛋白的菌株在MRS培養基發酵過程中，檢測到了高達50μmol/L的NO濃度，從而也表明這些菌株都具有產NO能力，從而促使了亞硝基肌紅蛋白的生成。目前大多數人支持Morita等[21]和等[24]的觀點，認為培養基或肉基質中并不含有足量的亞硝酸鹽，筆者也偏向于這種看法。

值得一提的是，以上涉及的可轉化高鐵肌紅蛋白，產生腌肉色澤，從而可替代或部分替代亞硝酸鹽的乳酸菌，包括植物乳桿菌、發酵乳桿菌和腸膜明串珠菌，它們對亞硝酸鹽有很好的降解作用，降解率在98%以上[32]，這可能與NO的生成機制有關。

4 展 望

近些年隨著人們對“綠色食品”和“有機食品”的日益重視[10]，亞硝酸鹽替代物研究勢在必行。微生物發酵法替代亞硝酸鹽發色研究已具備一定的條件，且已應用于多種肉制品實驗。由于其安全、綠色的優點，其替代前景廣闊。目前，這些微生物轉化高鐵肌紅蛋白的機制尚未清楚，未來的研究勢必應集中到亞硝基肌紅蛋白的生成機制上來，從代謝角度來闡明NO的生成途徑。然而由于至今沒有找到有效的肉毒梭菌抑制物質或方法來替代亞硝酸鹽，因此目前替代亞硝酸鹽的研究主要都是集中在發色、呈味等方面，不能達到完全替代的目的[33]。而對于微生物發酵法替代肉制品中的亞硝酸鹽，目前研究僅僅集中在發色方面，未來研究中需要對微生物進行進一步深入研究，來替代亞硝酸鹽的其他功能，諸如抑菌性、呈味和抗氧化性[34]，以期發酵法能完全替代亞硝酸鹽。

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Microbial Fermentation as an Alternative to Nitrite Addition for Colorizing Cured Meat Products:a Review

LI Pei-jun，KONG Bao-hua*，ZHENG Dong-mei
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

TS202.3

A

1002-6630(2010)17-0388-04

2009-12-30基金項目：國家公益性行業(農業)科研專項經費項目(200903012-02)；東北農業大學創新專項基金項目(CXZ011-2)作者簡介：李沛軍(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為畜產品加工與貯藏。E-mail：lipeijun1986@163.com*通信作者：孔保華(1963—)，女，教授，博士，研究方向為畜產品加工。E-mail：kongbh@163.com