脂肪源性間充質干細胞與肝病

陳耀凱 郭 艷

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有高增殖活性與多向分化潛能等干細胞特性，可在體外擴增分化成為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞及肝細胞等成體細胞。間充質干細胞來源廣泛，存在于骨髓、臍帶血、脂肪、滑膜、骨骼肌、肝臟、胰腺和血管等多種組織或器官中，不同來源的MSCs在生物學特性上無顯著差異。骨髓源性間充質干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BDMSCs）一直是干細胞領域的研究重點，但BDMSCs來源困難、取材不易，使其應用前景受限。相對于BDMSCs而言，脂肪源性間充質干細胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）來源豐富，取材容易，具有自我更新、多向分化和高增殖特性等重要干細胞特征，可望成為細胞工程和組織工程理想的種子細胞來源，已受到廣泛關注。

一、ADMSCs的生物學特性

2001年，Zuk等[1]首次從人類皮下脂肪組織中分離出一種多能干細胞，該細胞形成的克隆具有自我更新能力并可分化為多種組織，此即ADMSCs。ADMSCs與BDMSCs形態學特征極為相似。細胞于接種12～24h后完全貼壁，細胞呈圓球形、紡錘形或梭形，細胞核居中，可見雙核或多核。隨傳代次數增加，圓球形細胞逐漸減少，細胞形態以紡錘形或梭形為主。

有關ADMSCs特異性表面標志至今仍無統一認識，不同實驗室研究結果不盡相同，這種差異可能與細胞分離、培養和純化方法存在差異有關。Zuk等[2]研究發現ADMSCs表達CD13 而不表達 CD14、CD16、CD56、CD61、CD62E、CD104 和CD106。Gronthos等[3]通過流式細胞儀和免疫組化分析發現，ADMSCs蛋白質表達與BDMSCs非常相似，可表達CD9、CD10、CD13、CD29、CD34、CD44、CD49d、CD49e、CD54、CD55、CD59、CD105、CD106、CD146 及 CD166。但與 BDMSCs不同的是，ADMSCs不表達Stro-1抗原。Rodriguez等[4]研究發現，ADMSCs表達 CD44、CD105、CD49b、CD90 和 CD13 而不表達Stro-1、CD34、CD15、CD117、Flk-1、gly-A、CD133 和 HLR-DR。

在體內外特定誘導條件下，ADMSCs可分化形成多種細胞類型，如脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、神經細胞、肝細胞、心肌細胞、內皮細胞、胰腺內分泌細胞等。體外培養中，ADMSCs倍增時間一般為2～4天[5]。細胞傳代相對穩定、增殖旺盛，體外培養10代以后，細胞增殖速度仍無明顯減慢。傳代過程中端粒長度保持穩定，但端粒酶活性變化趨勢尚不肯定，有研究顯示端粒酶活性基本保持不變，但也有研究顯示端粒酶活性可能降低或消失[5]。

二、ADMSCs的多向分化潛能

與其他MSCs相似，ADMSCs在體外試驗中可誘導分化成為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞、內皮細胞及肝細胞等成體細胞。

（一）分化為脂肪細胞 王樂禹等[6]采用傳代培養2～4代的ADMSCs，在含胎牛血清、青鏈霉素原液、地塞米松、胰島素和LIBMX的高糖DMEM培養基中誘導培養1周，結果細胞內出現大量脂滴，油紅“O”染色可見胞漿內有大量紅染顆粒，表明ADMSCs在特定條件下分化成為脂肪細胞。Dicker等[7]發現ADMSCs可表達成熟脂肪細胞的某些重要特征，在鄰苯二酚胺的刺激下表現出脂解能力，在α2-腎上腺素受體的介導下可表現出抗脂解活性且可分泌一些典型的脂肪細胞因子，如脂聯素、瘦素等。而且，ADMSCs在多次傳代后仍保持向脂肪細胞的分化能力。

（二）分化為成骨細胞 鞠曉東等[8]研究證實在呋塞米、抗壞血酸和β-甘油磷酸鈉的共同誘導下，ADMSCs堿性磷酸酶表達量增加，細胞基質發生鈣化，骨橋蛋白、骨形態發生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）開始大量表達，表明其可分化為成骨細胞。ADMSCs向成骨細胞的分化過程受多種因子的調節，如Hattori等[9]研究發現BMP-2可上調Runx-2和骨橋蛋白基因的表達，促進ADMSCs的成骨性分化。制瘤素（oncostatin M，OSM）可通過誘導堿性磷酸酶、Runx-2和骨鈣素的表達及增加細胞基質鈣化而促進ADMSCs向成骨細胞分化[10]。相反，成纖維細胞生長因子-2（fibroblast growth factor-2，FGF-2）則可抑制ADMSCs向成骨細胞分化[11]。

（三）分化為軟骨細胞 有研究顯示，在含有轉化生長因子-1、胰島素和轉鐵蛋白的特定培養基誘導下，ADMSCs可向軟骨細胞分化，誘導后細胞表達前II型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖mRNA基因。FGF-2可通過誘導N-鈣粘蛋白、轉錄因子Sox-9的表達而促進ADMSCs向軟骨分化[12]。

（四）分化為心肌細胞 Rangappa等[13]采用5-氮胞苷（5-azacytidine，5-aza）在體外培養過程中誘導ADMSCs定向分化為心肌細胞，3周時可觀察到細胞出現自發搏動并可表達 α 肌動蛋白（α-actin）、心肌肌鈣蛋白 I（C-TnI）等心肌細胞特異性標志，研究者認為ADMSCs可望成為心肌細胞移植的細胞來源之一。

（五）分化為血管內皮細胞 ADMSCs具有向血管內皮細胞分化的能力，誘導分化的血管內皮細胞可分泌部分促血管生成因子，如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）等。管利東等[14]利用脂肪抽提術從脂肪組織中分離出ADMSCs，將其在含有馬血清、地塞米松、尼克酰胺、VEGF和FGF等的DMEM培養液中誘導培養，結果誘導后細胞具有血管內皮細胞的一些特性，能夠表達血管內皮細胞特異性表面標志CD34和vWF，具有很強的低密度脂蛋白攝取和前列環素代謝活力，并且在Matrigel凝膠中能夠形成毛細血管樣結構。

（六）分化為神經細胞 ADMSCs雖起源于中胚層，但可橫向分化為外胚層來源的神經細胞。周進等[15]用含有丁酸酯羥基茴香醚、KCL、丙戊酸、地塞米松和胰島素的培養液，誘導ADMSCs向神經細胞分化。誘導后細胞出現類似軸突和樹突樣結構，有類神經元間網絡形成，表達神經元特異性烯醇化酶。

（七）分化為胰腺內分泌細胞 Timper等[16]在activin-A、exendin-4、HGF及五肽胃泌素的誘導下，成功將人類ADMSCs分化成具有胰腺內分泌表型的細胞。這些分化細胞表達Isl-1、Pax-6、Ipf-1、Ngn-3及胰腺內分泌激素，如胰島素、胰高血糖素和生長抑素。

三、ADMSCs在肝臟疾病中的應用

在特定體外誘導條件下，ADMSCs具有向肝細胞分化的能力。Seo等[17]研究發現在HGF、OSM及二甲基亞砜（DMSO）的誘導下，ADMSCs逐漸向肝細胞分化，分化細胞表達白蛋白（ALB）和甲胎蛋白（AFP）等肝細胞表型，且具有攝取低密度脂蛋白及尿素合成功能。Banas等[18]研究發現，在HGF和FGF（FGF-1，FGF-4）的誘導下，來自于不同年齡患者的ADMSCs均可誘導為肝細胞樣細胞，這些細胞能夠表達多種肝特異性標志及功能，如白蛋白合成、低密度脂蛋白攝取和氨代謝功能等。Yamamoto等[19]通過聚類分析發現由ADMSCs分化而來的肝細胞和正常肝細胞在基因表達方面極為相似，表明ADMSCs經特定誘導后可在基因水平上表達肝細胞的某些特征。

Banas等[20]最近研究發現，將ADMSCs移植到CCl4誘導肝損傷的裸鼠體內，移植后受體裸鼠體內血氨、尿酸、ALT及AST水平逐漸趨于正常，表明植入裸鼠體內的ADMSCs對受損肝臟產生了明顯修復作用。他們還比較了ADMSCs、BDMSCs 及 NHDFs（normal human dermal fibroblasts，正常人皮膚成纖維細胞）誘導為肝細胞后在體外產生細胞因子和生長因子的能力，結果發現ADMSCs誘導的肝細胞在IL-1Rα、IL-6、IL-8、G-CSF、GM-CSF、MCP-1、NGF 和 HGF 的分泌量上要高于后兩者來源的肝細胞。IL-6是肝臟再生轉錄因子的關鍵誘導因子，是啟動肝細胞再生早期信號轉導機制中不可缺少的重要組成部分。HGF能顯著促進肝細胞再生，有利于肝細胞膜穩定性及肝功能恢復，促進血管內皮細胞生長和毛細血管再生。因此，作者認為ADMSCs在促進肝再生方面可能較BDMSCs更加有利。柳林等[21]經肝動脈途徑移植自體ADMSCs治療肝硬化患者8例，并與采用內科綜合療法的10例肝硬化患者進行對照研究。結果發現治療組血清ALT、ALB和PTA等肝功能指標的變化優于對照組，差異有統計學意義。研究者認為經肝動脈途徑移植自體ADMSCs治療晚期肝病短期療效確切。Vilalta等[22]研究發現，人類ADMSCs移植入人體后，細胞增殖狀態穩定，且移植后8個月內并未發現受體組織發生染色體異常及腫瘤形成。研究者認為ADMSCs移植可作為一種新型治療方法用于臨床治療終末期肝臟疾病，且肝臟是ADMSCs體內定植的首選器官。

有關ADMSCs的研究還發現一個有趣的現象，即ADMSCs對原位肝移植后排斥反應的發生有一定抑制作用，具體機制尚未完全明了，可能是因為ADMSCs干擾了樹突狀細胞、T淋巴細胞或NK細胞的功能而發揮免疫調節作用[23]。Wan等[24]新近研究發現，移植的ADMSCs可明顯抑制受體源性T淋巴細胞增殖，并且可顯著減輕原位肝移植大鼠模型急性排斥反應的發生率及嚴重程度。免疫抑制劑他克莫司（Tacrolimus）治療慢性肝移植物抗宿主?。℅VHD）可導致進行性腎功能損害，Fang等[25]對此類患者采取停用他克莫司給予ADMSCs移植治療，結果GVHD很快得到緩解，腎臟功能也有所改善，表明ADMSCs有可能作為一種臨床治療器官移植排斥反應的新方法。

四、小結與展望

綜上所述，ADMSCs具有強大增殖能力和多向分化潛能，有可能成為多種疾病治療的細胞來源，但ADMSCs研究時間較短，因而研究深度不及其他類型的MSCs，諸如ADMSCs分離培養、誘導分化及安全性等均有待進一步深入研究。今后的研究可能集中于以下幾個方面：（1）確定ADMSCs特異性細胞標記，并在此基礎上建立穩定的分離與純化方法；（2）基于不同分化方向建立不同的誘導分化方法，并盡量使之標準化、高效化；（3）致瘤性風險是制約干細胞臨床應用的重要因素，ADMSCs亦不例外，因此對于其安全性的評價也將是一個重要研究方向。

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