離子交換層析純化重組福安泰-03功能域的工藝條件研究

2010-04-21 05:17:50蘇偉明馬潤娣于立堅廣東海洋大學海洋藥物研究與開發重點實驗室廣東湛江524025

長江大學學報(自科版) 2010年4期

蘇偉明,馬潤娣,于立堅 (廣東海洋大學海洋藥物研究與開發重點實驗室,廣東湛江524025)

于廷曦 Cell Biology Group,Department of Surgery,Department of Pathology,University of Maryland School of Medicine and Baltimore Veterans Affairs Medical Center,Baltimore,MD 21201,USA

離子交換層析主要利用蛋白質等電點 (pI)的差異使其分離,即在一定的緩沖體系中,不同蛋白質與離子交換凝膠有不同的結合能力,而不同濃度的NaCl可以把不同結合力的蛋白質從層析柱上先后洗脫下來。由于離子交換層析具有處理量大、分辨率較高和成本低廉的特點[1],因此,該技術在眾多蛋白質分離中得到廣泛應用。

福安泰-03(Fuantai-03,FAT-03)功能域從赤魟組織中分離得到,分子量大約為43000Da,具有強抗血管生成活性和強抗腫瘤生長和轉移作用[2～5]。將用DNA重建技術構建的、含FAT-03功能域基因的質粒整合入 BL121(DE3)大腸桿菌中,其表達的蛋白質即重組福安泰-03功能域 (recombinant functional domain of Fuantai-03,rFAT-03)。將重組福安泰-03功能域分離純化是獲得具有實用價值產品的關鍵步驟。下面,筆者在20℃、上樣量一致、層析介質相同的條件下對離子交換層析純化重組福安泰-03功能域功能域的工藝條件進行了研究。

1 試驗部分

1.1 材料

HiTrap Desalting5×5ml(17-1408-01)脫鹽預裝柱、HiT rap DEAE Sepharose FF瓊脂糖凝膠、XK 26/20柱均為美國GE公司產品;L-還原型谷胱甘肽 (AMRESCO公司);Tris(Genriew公司);丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、T EMED、SDS購自北京鼎國生物廣州分公司,其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器

AKTA explorer 100蛋白質快速純化開拓系統 (美國GE公司);Avant J-25大容量高速冷凍離心機 (美國貝克曼公司);3K30高速冷凍離心機 (德國SIGMA公司);420A pH計 (美國奧力龍公司);Mini trans垂直電泳槽加轉印系統 (美國Bio-Rad公司);FR-1000凝膠成像系統 (上海復日公司);Milli-Q RG(美國Millipore公司);2501紫外分光光度計 (日本島津公司)。

1.3 試驗方法

1)樣品處理調整原液蛋白濃度為1mg/ml,上樣體積為400ml,用0.22μ m濾膜過濾,脫氣10min。

2)緩沖液的配制上樣緩沖液 (0.1 mol/L Tris-HCl)的配制過程如下:稱取Tris 12.11g,加去離子水500ml,攪拌溶解。用0.1mol/L HCl調pH至8.8,用去離子水定容至1000ml;洗脫緩沖液(1mol/L NaCl+0.1 mol/L T ris-HCl)的配制過程如下:稱取Tris 12.11 g和NaCl 58.44 g,加去離子水500 ml,攪拌溶解。用0.1 mol/L HCl調pH至8.8,用去離子水定容至1000ml。

3)離子交換層析采用XK26/20柱,填料為DEAE Sepharose FF瓊脂糖凝膠 (50ml),在AKTA explorer 100蛋白質快速純化開拓系統上進行。用上樣緩沖液平衡5個柱床體積以上,至基線平穩。通過上樣泵上樣400ml,流速8ml/min。上樣完畢后,用上樣緩沖液洗至基線平穩,再用洗脫緩沖液采用以下3種不同洗脫條件進行洗脫:①線性梯度洗脫。即用洗脫緩沖液從0%到100%洗脫6個柱床體積,收集洗脫峰。②固定梯度和線性梯度混合洗脫。先用20%洗脫緩沖液直接洗脫3個柱床體積,再用洗脫緩沖液從20%到100%洗脫2個柱床體積,收集洗脫峰。③不同階段線性梯度洗脫。先用洗脫緩沖液從30%到60%洗脫3個柱床體積,再用洗脫緩沖液從60%到100%洗脫2個柱床體積,收集洗脫峰。

4)脫鹽采用HiTrap脫鹽柱進行脫鹽,上樣1ml,流速5ml/min,收集樣品。

5)總蛋白量測定采用Lowry法[6],以牛血清白蛋白為基準。

6)SDS-PAGE電泳利用SDS-聚丙烯酰胺電泳[7]測定粗品和層析分離后樣品的純度,分離膠為10%聚丙烯酰胺凝膠,考馬斯亮藍染色。用 FR-1000凝膠成像系統處理SDS-PAGE凝膠。利用SMART VIEW分析軟件對電泳圖譜進行分析。

7)UNICORN 5.11軟件分析用UNICORN 5.11軟件對離子層析圖譜進行分析。

2 試驗結果與分析

用UNICORN 5.11軟件對離子層析圖譜進行得率分析和SMART VIEW分析軟件對電泳圖譜進行純度分析,3種不同洗脫條件下的具體分析結果如下。

2.1 線性梯度洗脫

采用線性梯度洗脫時,其離子交換層析圖譜如圖1(a)所示,由圖1(a)可知出現2個洗脫峰,1#得率只有11.16%,2#得率為88.84%。SDS-PAGE電泳圖如圖2(a)所示,由圖2(a)可知,1#峰為目的蛋白,但有雜帶,純度為90.1%,2#峰中有目的蛋白,但分離不完全。

2.2 固定梯度和線性梯度混合洗脫

采用固定梯度和線性梯度混合洗脫時,其離子交換層析圖譜如圖1(b)所示。由圖1(b)可知出現3個洗脫峰,3個峰分離不完全,1#得率為27.73%,2#得率為11.75%,3#得率為60.51%。SDS-PAGE電泳圖如圖2(b)所示。由圖2(b)可知,1#峰為目的蛋白,純度為99.5%,2#有部分目的蛋白。

2.3 不同階段線性梯度洗脫

采用不同階段線性梯度洗脫時,其離子交換層析圖譜如圖1(c)所示。由圖1(c)可知出現2個洗脫峰,1#和2#分離比較完全,1#得率為35.97%,2#得率為64.03%。SDS-PAGE電泳圖如圖2(c)所示。由圖2(c)可知,1#為目的蛋白,呈單一條帶,純度為99.5%,2#基本上無目的蛋白。

綜上所述,采用不同階段線性梯度洗脫時,重組福安泰-03功能域和小分子物質已完全分離開來,目的蛋白純度很高,且得率最高。因此,使用該洗脫條件可獲得最佳分離純化效果。

3 結語

在上樣緩沖液為0.1mol/L Tris-HCl、洗脫緩沖液為1mol/L NaCl+0.1mol/L T ris-HCl、pH為8.8的條件下,利用HiTrap DEAE Sepharose FF瓊脂糖凝膠吸附柱,先用洗脫緩沖液從30%到60%洗脫3個柱床體積,再用洗脫緩沖液從60%到100%洗脫2個柱床體積,最后收集洗脫峰。通過上述操作能獲得最佳分離純化效果,即重組福安泰-03功能域的純度最高,得率最大。因此,該試驗條件的確定為制備足量高純度重組福安泰-03功能域提供了重要參考。