五步蛇毒抗腫瘤組分X對小鼠生殖毒性及F1子代的影響

逄朝霞，魯文清，翟瑞仁，郭廷凱

蛇毒是由蛇的毒腺分泌的一種天然毒蛋白，成分復(fù)雜，主要含蛋白質(zhì)、多肽及一些酶類，具有廣泛的生物學(xué)活性，可作為天然的藥用資源。在抗腫瘤方面很有潛力[1]，然而蛇毒中含有多種復(fù)雜成分，這些成分可能會引起臨床不良反應(yīng)[2]。本實驗將提取的五步蛇毒抗腫瘤組分X（FX）按照低劑量組為2.5 mg/kg，中劑量組為5 mg/kg，高劑量組為10 mg/kg；第4組為生理鹽水陰性對照組（CK），經(jīng)尾靜脈注入鼠體，通過觀察五步蛇毒抗腫瘤組分X對雄鼠、孕鼠一般生殖毒性、圍產(chǎn)期毒性的影響，提示，五步蛇毒抗腫瘤組分X在5 mg/kg劑量下應(yīng)用于臨床是安全的。現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料 五步蛇（Agkistrodon Acutus）蛇毒凍干粉，遼寧省清源縣，DEAE-sepharose瓊脂糖凝膠，瑞典Pharmacia公司。性成熟昆明種小鼠，體重（35±2）g，未交配過，由中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 蛇毒抗腫瘤組分X的分離純化 DEAESepharose離子交換色譜：稱取五步蛇毒凍干粉20 g，用0.02 mol/L pH7.8的Tris-HCl緩沖液溶解。溶液以離心半徑8 cm 4 000 r/min離心20 min，取上清，透析12 h后，以6.0 ml/min的流速上陰離子交換柱（DEAE-Sepharose）。上樣完畢后以0.02 mol/L pH7.8的Tris-HCl緩沖液洗脫未吸附的雜蛋白，待透過峰下到基線時，分別用0.02 mol/L Tris-HCl含0.05 mol/L和0.1 mol/L氯化鈉的緩沖液進行梯度洗脫收集活性峰。

1.2.2 一般生殖毒性實驗[3]①分組與給藥：選狀態(tài)良好、發(fā)育正常的雄性小鼠120只，雌性120只，分別將雌雄小鼠進行隨機分組，雄性4組，每組30只，雌性4組，每組30只；給藥劑量參考一般毒理學(xué)實驗結(jié)果[4]，低劑量組為 2.5 mg/kg，中劑量組為5 mg/kg，高劑量組為10 mg/kg，第4組為生理鹽水陰性對照組（CK）；雄性小鼠交配前連續(xù)尾靜脈給藥60 d，雌性小鼠交配前連續(xù)尾靜脈給藥14 d，按雌雄1∶1合籠交配，觀察陰栓的有無確定是否有交配行為，有交配行為的雌鼠當(dāng)天定為妊娠d0，妊娠時間相同或相近的雌鼠分成一組，每組25只，共4組；對雌孕鼠繼續(xù)給藥至妊娠第15天；稱體重1次/3 d，給藥量0.1 ml/只小鼠，根據(jù)體重變化調(diào)整；②觀察指標(biāo)：對于雌鼠，一般綜合指標(biāo)包括測定動物用藥期間體重和進食量，觀察精神狀態(tài)和活動情況，稱體重1次/周，觀察交配行為，計算受孕率等；對于雄鼠，測定動物用藥期間體重和進食量，觀察精神狀態(tài)和活動情況，交配后處死，檢查精子活動度、精子數(shù)量和精子形態(tài)，稱睪丸和附睪重量，計算重量系數(shù)，對睪丸組織進行病理檢查；在妊娠第18天處死動物并剖腹，計算受孕率，死胎數(shù)、活胎數(shù)、總著床數(shù)、吸收胎數(shù)、有死胎孕鼠數(shù)、子宮連胎重和孕0~14 d母鼠增重，觀察活胎的外形，記錄外形畸變率，對隨機抽出的2/3胎仔用茜素紅染色后做骨髓檢查，記錄骨髓畸變率，其余1/3胎仔經(jīng)Bouin液固定后用徒手切片法檢查內(nèi)臟缺陷，包括肝、心、肺、腎、腦、睪丸、卵巢、子宮等臟器，記錄內(nèi)臟畸變率并計算總畸形率。

1.2.3 圍產(chǎn)期毒性試驗[4]①分組與投藥：選狀態(tài)良好、發(fā)育正常的雄性小鼠120只，雌性120只，分別將雌雄小鼠進行隨機分組，雄性4組，每組30只，雌性4組，每組30只；給藥劑量參考一般毒理學(xué)實驗結(jié)果，設(shè)計低劑量組為2.5 mg/kg，中劑量組為5 mg/kg，高劑量組為10 mg/kg，第4組為生理鹽水陰性對照組（CK）；按雌雄1∶1合籠交配，觀察陰栓的有無確定是否有交配行為，有交配行為的雌鼠當(dāng)天定為妊娠d0，妊娠時間相同或相近的雌鼠分成一組，每組25只，共4組；從妊娠第15天開始每天用藥直至分娩后21 d；②觀察指標(biāo)：孕鼠分娩后第7天每窩保留8只仔鼠，不足8只棄去，分別于產(chǎn)后第1、4、8、12、16、21天稱重； 仔鼠出生后第5天測試以下指標(biāo)：翻正反身：記錄仔鼠腹面朝上轉(zhuǎn)為四肢著地所需的時間，記錄≤10 s和>10 s的仔鼠數(shù)；陰性趨地性試驗：仔鼠放在傾斜25°斜面上，頭部向下，仔鼠會自動轉(zhuǎn)向使其頭朝上，觀察頭部轉(zhuǎn)向180°所需時間 ，以大于和小于20 s為界，記錄仔鼠數(shù)；斷崖回避試驗：將仔鼠頭部置于臺面外，觀測仔鼠鼻尖退回臺邊緣所需時間，記錄大于和小于20 s的仔鼠數(shù)；游泳能力試驗：用仔鼠游泳試驗檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育情況，仔鼠放入26℃水中游泳15 s，記錄直線游動、圓圈游動、浮在水面及下沉的仔鼠數(shù)。

隨機取產(chǎn)后2個月F1代仔鼠雌雄各10只進行隨機交配試驗，觀察F1代雌鼠的受孕率和胚胎發(fā)育情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件，各組觀察指標(biāo)求出±s，組間比較用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 一般生殖毒性實驗

2.1.1 雄鼠 各組動物用藥期間精神狀態(tài)良好，尿、大便和皮毛未因長期用藥而發(fā)生變化，飲水量和食物消耗量與對照組無顯著差異。對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組體重增長值分別為：（9.21±2.38）、（9.40±3.12）、（9.01±1.92）、（6.93±1.87）g，給藥期間，高劑量組體重增長受到限制，說明高劑量組雄鼠已產(chǎn)生毒性反應(yīng)，高劑量組雄鼠睪丸系數(shù)與CK組比較有增加，但病理檢查未見退變及壞死等病理反應(yīng)，可認(rèn)為睪丸系數(shù)的相對增加主要是由于體重減少，造成睪丸質(zhì)量相對增加所致。精子量、精子活動度、交配頻度和雄鼠的生育率未見明顯差異。

2.1.2 雌鼠 試驗期間各組動物精神狀態(tài)良好，尿、大便和皮毛未因長期用藥而發(fā)生變化，飲水量和食物消耗量與對照組無明顯差別，受孕率也未見明顯改變，但高劑量組雌鼠體重增長受到明顯限制，說明高劑量組有中毒反應(yīng)。

2.1.3 孕鼠和胎鼠 各試驗組孕鼠在妊娠期間一般健康狀況良好，高劑量組孕鼠體重增加和子宮連胎重兩項指標(biāo)與CK組比較有差別，其它指標(biāo)與CK組比較均無差別，見表1。

2.2 圍產(chǎn)期毒性試驗 見表2。

2.2.1 對仔鼠體重的影響 高劑量組新生仔鼠體重與CK組相比減少，有顯著性差異（P<0.05），但出生后第21天各組仔鼠體重與CK組相比較無明顯差別。

2.2.2 對其它體征的影響 各劑量組仔鼠開耳、長牙、睜眼時間與CK組相比均無明顯差別（P>0.05）,反映神經(jīng)功能的指標(biāo)（翻正反向，陰性趨地試驗，斷崖回避試驗和游泳能力）各劑量組仔鼠與CK相比也無明顯差別。

2.2.3 對F1子代生殖功能的影響 與CK相比，各劑量組F1子代小鼠交配能力，受孕率，總著床數(shù)，活胎數(shù)，死胎數(shù)，吸收胎數(shù)，子宮連胎重和總畸形率無明顯差別（P>0.05）。

3 討 論

發(fā)育中的胚胎對外界毒物非常敏感，往往在對成體不產(chǎn)生毒性的劑量下，對胚胎就可產(chǎn)生毒性，從而引起發(fā)育停滯和出生缺陷[5]。有關(guān)妊娠期受毒性藥品影響胚胎發(fā)育，造成著床數(shù)減少、死胎和吸收胎數(shù)增加或影響出生子代生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的報道很多[6]。孕前或孕期遭受毒物會延緩胚胎的正常發(fā)育，導(dǎo)致發(fā)育停滯或死亡，出現(xiàn)吸收胎，活胎體重減輕，胎仔脊柱裂、腭裂、性腺發(fā)育不良等畸形；本文結(jié)果表明，在高劑量組條件下胚胎體重明顯低于陰性對照組，而在5 mg/kg劑量組與CK相比沒有明顯差異，故在10 mg/kg體重劑量下有可能對胚胎造成影響，但由于沒有劑量效應(yīng)關(guān)系，所以不能肯定在10 mg/kg劑量下就產(chǎn)生胚胎毒性，在現(xiàn)有條件下，該實驗可以證明，在5 mg/kg劑量時未對雄鼠或孕鼠產(chǎn)生毒性，提示此劑量下FX應(yīng)用于臨床可能是安全的。

出生前暴露于外源性毒素能引起雄性子代生殖系統(tǒng)發(fā)育異常，如隱睪，睪丸、附睪重量減輕，精子數(shù)目減少，這是檢測外源性毒素樣物質(zhì)作用的指標(biāo)[7]。本文結(jié)果表明，F(xiàn)X對雄鼠睪丸無毒性反應(yīng)劑量大約為5 mg/kg體重，用10 mg/kg劑量處理時對雄鼠的體重和睪丸系數(shù)都有一定的影響，但病理檢查未見退變及壞死等病理反應(yīng)，可認(rèn)為睪丸系數(shù)的相對增加主要是由于體重減少，造成睪丸質(zhì)量相對增加所致。精子量、精子活動度、交配頻度和雄鼠的生育率未見明顯差異。故僅憑本文結(jié)果不能斷定高劑量組具有生殖毒性，但在5 mg/kg體重劑量藥物應(yīng)該是安全的，還有待于臨床的進一步研究。

[1]吳保平，高春芳，張亞歷，等.東亞鉗蝎毒生物提取物對人大腸癌細胞的體外抑殺實驗.中國肛腸病雜志，.1993，4(1):3-6.

[2]Kiechle FL，Zhang X.Apoptosis:biochemical aspects and clinical implications.Clinica Chimica Acta，2002，326(1-2):27-45.

[3]董偉華，臧夢維，孔天翰，等.蝎毒組分Ⅱ?qū)θ撕戆┘毎拘缘难芯?中國醫(yī)藥學(xué)報，1994，4(1):9-11.

[4]Muggia FM.Relevance of chemotherapy dose and schedule to outcomes in ovarian cancer.Semin Oncol，2004，31(6 Suppl 15):19-24.

[5]蘇智廣，梁愛華，袁靜明.東亞鉗蝎神經(jīng)毒素的研究進展.山西大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，1997，20(3):343-7.

[6]鄭智敏，王成裕，田中嶺，等.蝎毒對人腫瘤細胞株和動物移植性腫瘤的作用.河南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1995，30(4):351-3.

[7]Hammou Oubrahim，Jun Wang，Earl R，et al.Molecular cloning and characterization of murine caspase-12 gene promoter.Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102(7):2322-27.

表1 FX激肽原酶對雌性小鼠F0生殖功能的影響

表2 蛇毒激肽原酶對F1仔鼠一般體征的影響（±s）

表2 蛇毒激肽原酶對F1仔鼠一般體征的影響（±s）

?