粉葛有效部位提取工藝實驗研究*

孫 靜 錢 平 嚴建業 陜西中醫學院藥學院(咸陽 712046)

粉葛為豆科植物甘葛藤 Pueraria thomsonii Benth.的的干燥根,具有解肌退熱,透疹,生津止渴,升陽止瀉的功效。葛根的有效部位為其所含的異黃酮類物質,如大豆苷、大豆苷元、葛根素等。其中葛根素(puerarin)是本屬的特有成分,也是主要的有效成分。近年來國內對葛根所含化學成分的藥理作用和臨床應用方面的研究不斷增加。研究表明[1],葛根煎劑、浸提劑和總黃酮都有一定的降壓效果。目前葛根異黃酮的提取方法[2]主要有鉛鹽沉淀法,不同濃度的甲醇、乙醇回流和冷浸提取法,水飽和正丁醇冷浸法,水飽和正丁醇萃取—硅膠柱層析等。結合生產實際,選擇乙醇回流法提取葛根有效部位,得到科學合理的工藝參數,為該藥材大生產的應用進一步奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器 調溫電熱套(型號:ZDHW河北省黃驊市中興儀器有限公司);電子恒溫水浴鍋(型號:GKC-11-CR2上海金橋科析儀器廠);遠紅外快速恒溫干燥箱(型號:YHG-40×45上海躍進醫療器械廠);高效液相色譜儀(Waters 600 Controller,Waters 600Pump);紫外檢測器(Waters2478Dual λ Absorbance Detector)。

1.2 藥品與試劑 根購自西安盛興中藥飲片有限責任公司(批號:20060330來源:廣西 ),經鑒定為豆科植物甘葛藤的根,習稱粉葛;葛根素化學對照品(0752-9907中國藥品生物制品檢定所);無水乙醇(洛陽市化學試劑廠)為分析純;水為自制的蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 正交實驗設計 影響乙醇回流提取效果的因素有乙醇濃度、溶劑用量、回流時間和提取次數,根據資料對每個因素選取 3個不同水平,進行正交實驗優選提取工藝,見表 1。

表1 因素水平表

2.2 供試品的制備 將葛根碾成粗粉,稱取50g,共 9份,分別置于 1000mL圓底燒瓶中并標記,然后按照表 2的正交實驗設計方案進行回流提取,合并提取液并過濾,濾液回收乙醇,水浴蒸至近干,然后放入烘箱中 80℃干燥 50個 h,可得到深棕色干浸膏。將干浸膏置于干燥器中冷卻至室溫,精密稱重。

2.3 葛根素的含量測定

2.3.1 對照品溶液的配制:精密稱取葛根素化學對照品 0.0112g,用 30%乙醇溶解,定容至 25mL,搖勻。精密移取該溶液 2mL置 10mL容量瓶中并用 30%乙醇定容,最后用 0.45 μm微孔濾膜濾過,搖勻,即得濃度為 0.0896mg/mL葛根素對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的配制:精密稱取各干浸膏20mg,用 30%乙醇溶解,定容至 10mL,搖勻,用 0.45 μ m微孔濾膜濾過,標記,即得各供試品溶液。

2.3.3 供試品溶液的測定:色譜條件:Kromasil色譜柱 250×4.6mm,填充劑:十八烷基硅烷鍵和硅膠 ,流動相:乙腈 -水 (14∶ 86),流速:1.00mL/min,檢測波長:250nm。

精密吸取對照品溶液和供試品溶液各 10 μ l,分別注入液相色譜儀,所得結果如表 3所示。

表3 HPLC測定數據表

2.3.4 測定數據的處理:由已知數據可計算出葛根素對照品溶液的濃度為 89.6 μ g/mL,利用外標法公式[4]計算出供試品溶液中葛根素的含量。

已知供試品溶液的濃度和供試品溶液中葛根素的濃度,經計算可得出浸膏中葛根素的含量。以所得浸膏重量(x)最高者 5.2625g計 30分,以浸膏中所含葛根素總量(y)最高者 66.15mg計 70分,可得綜合評分(z)=30x/5.2625+70y/66.15。以綜合評分為(z)指標進行極差(R)的計算及方差分析,結果見表 4、5。

表4 正交實驗表

表5 方差分析表

當 α=0.05時 ,F α(2,2)=19.00,則 A、 D兩因素的 F值滿足 P{F(2,2)＞ F α(2,2)}=0.05,此二因素三個水平的變動對實驗結果的波動影響較大,有顯著性;當 α=0.01時 ,F α(2,2)=99.00,則只有 A因素的F值滿足 P{F(2,2)＞ F α(2,2)}=0.01,該因素水平的變動對實驗結果的波動影響非常大,極顯著。

由于正交表上的各列剛好填滿,故選取方差來源中離差平方和最小的一個近似作為誤差的估計,即SSe≈ SSB=49.85,fe=2。

2.4 結果 由極差 R的計算可看出 RA＞RD＞ RC＞ RB,即對該工藝影響最大的因素是乙醇濃度,其次是提取次數、回流時間,溶劑用量影響最小。

由表 4可知最佳提取工藝是 A1B2C2D2。由于經方差分析得知 B、C二因素不顯著,所以考慮到生產實際的需要,可以選用工藝 A1B1C1D2。

2.5 驗證性實驗 將葛根碾成粗粉,稱取 50g,共 3份,置于 1000mL圓底燒瓶中并標記,然后按照優選的 A1B1C1D2工藝條件進行回流提取,合并提取液并過濾,濾液回收乙醇后在 100℃水浴上蒸至近干,然后放入烘箱中 80℃干燥 50個小時,可得到深棕色干浸膏。將干浸膏置于干燥器中冷卻至室溫,精密稱重,所得干浸膏重量分別為:①4.5364g② 4.9525g③4.8367g精密稱取各干浸膏 20mg,用 30%乙醇溶解,定容至 10m L,搖勻,用 0.45 μ m微孔濾膜濾過,標記即得驗證性試驗的各供試品溶液。用 HPLC法測定各供試品溶液中葛根素的含量(色譜條件同前),經計算可得出各浸膏中葛根素的含量:①65.32mg②69.83mg③67.23mg結果表明采用工藝 A1B1C1D2提取葛根有效部位,效果較好。

3 結 語 乙醇回流法是提取葛根黃酮的一種經典方法,提取效率高,與使用其他有機溶劑提取相比具有安全環保、經濟、簡便易行的特點,與水煎煮法相比具有提取物純度較高的優點,在實際生產中使用較廣泛。本文通過 L9(34)正交實驗和驗證性實驗優選出乙醇回流法提取葛根有效部位的工藝條件,即采用6倍量 70%的乙醇,提取 2次,每次 1h,工藝可行,適合工業應用。

[1] 沈映君.中藥藥理學[M].上海:上海科學技術出版社,1997:36-38.

[2] 張夢軍 ,吳世容,李志良.幾種提取葛根異黃酮的方法比較及實驗優化 [J].中成藥,2005,27(10):1133-1135.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部.2005版[M].北京:化學工業出版社 ,2005:233-234.

[4] 張廣強 ,黃世德.分析化學 (下冊 儀器分析)[M].北京:學苑出版社,2001:376.