板黨、五鶴續斷、天麻及頭頂一顆株對抗氧化酶表達作用的比較

詹光杰 湖北民族學院醫學院 (恩施 445000)

需氧生物在氧化還原循環中往往產生大量的超氧陰離子自由基(O2-)、羥自由基(OH)、過氧化氫 (H2O2)等活性氧。此外,酶促反應、電子傳遞及小分子自身氧化等細胞正常的代謝過程也會產生活性氧。活性氧是自由基的重要組成部分,少量的自由基是生物體所必需的,它們作為第二信使,對信號傳導起重要的作用,影響基因的表達,但是自由基的性質極為活潑,過多的自由基如果不能被及時清除,它們將會攻擊各種生物大分子,引起 DN A損傷、酶失活、脂質過氧化等一系列氧化損傷,進而引起生物體各種生理病變[1～2]。

生物體在長期的進化過程中,形成了一套完整的保護體系-抗氧化系統來清除體內多余的活性氧。如超氧化物歧化酶(super oxide dismutase,SOD),谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)等。 SOD在清除活性氧反應過程中第一個發揮作用,它將超氧陰離子自由基快速歧化為過氧化氫和分子氧;過氧化氫在過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶的作用下轉化為水和分子氧。所以,SOD和 GPX具有清除氧自由基,保護細胞不受氧化損傷的作用。而且其活性或含量的變化往往與生物體的免疫力是密切相關的。

板黨為桔梗科黨參屬植物,因生長在湖北恩施板橋而得名,其根含有豐富的多糖、甾醇、苷類、氨基酸、膽堿及微量元素等,是非常好的滋補品;續斷又名龍豆,為川續斷科草本植物,其成分含有三萜皂甙類、揮發油、甾醇類、生物堿、黃酮等有效成分,五鶴續斷因生長于特殊的地理生態環境的湖北省五峰縣和鶴峰縣而得名,其產量大、質量優,是名副其實的道地藥材;天麻為蘭科植物,天麻的干燥塊莖古名赤箭,在我國有悠久的用藥歷史,主要成分為天麻素、香莢蘭醇、對羥基苯甲醛和對羥基芐醇等,近年來對抗衰老和促進學習記憶作用越來越受到重視;頭頂一顆株為百合科植物,主要成分含甾體皂甙和延齡草二葡萄糖甙,以根入藥。本實驗采用板黨、五鶴續斷、天麻及頭頂一顆株注射液給實驗動物腹腔注射,通過對各組動物組織超氧歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)含量測定的比較分析,探討其改善中樞神經系統功能、延緩衰老,進而比較它們的差異性。

1 材料與方法 1.1 注射液制備 藥材由恩施州中藥材生產 GAP(質量管理規范)示范基地提供,采用水提醇沉淀法制成含生藥 30%的注射液,瓶裝密封消毒備用。

1.2 實驗藥品與儀器 氟哌啶醇注射液,湖南洞庭藥業股份有限公司生產;SOD、GPX試劑盒,南京建成生物工程研究所生產;回避反應箱,華中科技大學同濟醫學院提供;GL-20GII型高速低溫離心機;UV-2450分光光度儀;水浴箱。

1.3 實驗分組 雄 Wistar大鼠 60只,鼠齡 40～ 50周,體重 300～ 350g(華中科技大學同濟醫學院動物中心提供),隨機分對照組、模型組、板黨實驗組、五鶴續斷實驗組、天麻實驗組和頭頂一顆株實驗組 ,每組 10只。對照組生理鹽水 10只;模型組:氟哌啶醇 10只;實驗組氟哌啶醇+注射液各 10只。

1.4 電跳臺行為學訓練及測試 實驗裝置為 30 cm×30cm回避反應箱,箱底為銅柵,可通刺激電流。另有一高 5cm,頂端直徑為 5 cm的橡膠圓臺作為避電擊平臺,固定放置在箱內一角的銅柵上,大鼠可在圓臺上停留以回避電擊。實驗開始時,先將大鼠輕放于回避反應箱內,使其適應 3～ 5 min以消除探究反應。底部銅柵通電(36V)2s大鼠在受電擊刺激中逐漸學會跳上平臺回避電擊。多數大鼠可能再次或多次跳至銅柵上,受到電擊后又重新跳回平臺,如此訓練 3min,并記錄每只大鼠受電擊數或犯錯次數,以此作為學習成績,如此持續 3d,直至每只鼠的犯錯次數為 0～ 1。剔除犯錯次數 2次以上的大鼠,然后根據學習成績將大鼠均分至各實驗組。

1.5 給藥途徑和劑量 實驗動物在行為學訓練和測試結束后,除對照組外,模型組、實驗組均按每克體重腹腔注射 0.001mg氟哌啶醇注射液,每天 2次,持續 3d。實驗組在繼續注射氟哌啶醇的同時,再按每克體重腹腔注射 0.003mL黨參注射液,每天二次,持續 7d。對照組每天等量腹腔注射生理鹽水,每天二次,持續 7d。

1.6 組織 SOD、GPX測定 實驗動物注射實驗結束后,再測試行為學改變并記錄,隨后斷頸處死。迅速取血及各種組織,血液離心取血清,組織制成 10%勻漿,備用。 SOD、GPX測定,按試劑盒說明書進行,蛋白定量采用雙縮目尿法測定。

1.7 統計學方法 所有結果都用 SPSS12.0統計軟件進行處理,進行 ANOV A顯著性分析及 S-N-K和 LSD進行組間兩兩比較,文中描述性統計值用平均值±SE,P＜0.05為差異性顯著。

2 結 果 組織 SOD與 GPX的改變,實驗組與對照組、模型組比較,四種注射液都有不同程度的上調抗氧化酶的表達 ,在血、海馬和腦皮質更為明顯(圖 1、2),但不同的注射液上調存在差異性。

圖1 對大鼠血及組織 SOD的影響比較

圖2 對大鼠血及組織 GPX的影響比較

討 論 衰老是機體生物發育成熟后,機體的生理功能逐漸下降,組織器官逐步發生退行性改變,并最終走向衰亡的過程,其機制復雜,并與多種因素有關。多數學者認為,體內自由基的濃度與衰老關系密切,隨著年齡的增長,抗氧化酶活性不斷下降,體內產生的過量氧自由基無法及時清除,造成細胞代謝和功能形態的改變 ,致使細胞衰老。SOD和 GPX作為重要的抗氧化酶系,其表達變化已成為檢測衰老因素最為敏感和可靠的指標[3～4]。根據氟哌啶醇可使實驗動物產生僵住癥(強直性昏厥,catalepsy)的原理,建立實驗動物快速老化模型,對 SOD和 GPX有抑制作用,是很好的動物老化造模劑[5～6]。本實驗選用了富硒板黨、五鶴續斷、天麻和頭頂一棵株等四味傳統中藥作為實驗注射液,結果表明,四種中藥都能顯著上調 SOD和GPX的表達量,都是有效的抗氧化藥物,但在提高 SOD和GPX的表達值上還存在明顯的差異性。在血和肝中,天麻的上調作用最強,而在腎、海馬和腦皮質中則頭頂一棵株上調作用最好,在整個上調表達上 ,富硒板黨和五鶴續斷比較均一,提示這四種中藥在不同組織器官作用的靶點可能不一樣的,作用的效果也不一樣,同時也表明不同的中藥材雖然都有抗衰老的作用,但其作用機理還是存在差異性的,顯然與四種藥材的主要成分不一致是有關的。作為篩選抗衰老藥物的前期實驗,我們認為,不少中草藥都具有抗衰老的作用,但是如何找到最佳的還需要進一步的研究,實驗也表明不同的中草藥由于主要成分的差異,作用機制不同,抗衰老的效果也不一樣,如何弄清是何種成分在起關鍵作用還有待于研究。

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