增損甘露消毒丹對肝纖維化大鼠肝組織MMP-1和 TIM P-1的影響

李長秦 孫守才 袁曉棟 馬娟娟 王禮鳳 鄭旭銳 陜西中醫(yī)學院 (咸陽 712046)

慢性病毒性肝炎,長久不愈均可致不同程度肝纖維化,早期的纖維化是可逆的,但到后期有再生結(jié)節(jié)形成時則不可逆轉(zhuǎn)[1]。因此,阻止肝纖維化的形成與發(fā)展,對預防肝硬化甚至肝癌具有重要的意義。增損甘露消毒丹 (ZSGLXDD)經(jīng)過長期、大量的臨床使用和療效檢驗,其治療慢性肝炎、延緩肝纖維化進程的良好療效已經(jīng)得到肯定,是一個成熟并且安全有效的中藥方劑。該方不僅具有抑制病毒復制及調(diào)整免疫功能的作用,而且具有保護肝細胞、修復肝損害、恢復肝功能、延緩肝纖維化進程等作用[2]。本實驗研究旨在通過采用四氯化碳(CCL4)成功制備肝纖維化大鼠模型的基礎上,應用免疫組化的方法測定各組大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MM P-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIM P-1)的含量,從而探討增損甘露消毒丹抗肝纖維化的作用機制。

1 實驗材料與方法 1.1 實驗動物 SD大鼠 63只,雄性,清潔級,體重(200±20)g,由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心購進。動物合格證號:SCXK2007-001。

1.2 藥物及試劑 CCL4分析純:500mL/瓶,天津市致遠化學試劑有限公司生產(chǎn),批號:20070403。復方鱉甲軟肝片(FFBJRGR):內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司出品 0.5g/片,生產(chǎn)批號:20070130,蒸餾水溶解為 0.625g/mL。 SP試劑盒:北京博奧森生物制品有限公司生產(chǎn),批號:20081118。MM P-1,TIM P-1抗體:均為 0.1mL濃縮型,由北京博奧森生物制品有限公司生產(chǎn),批號:20081118。增損甘露消毒丹由葉下株、連翹、蒼術、丹參、僵蠶、姜黃等藥物組成,購自陜西中醫(yī)學院國醫(yī)堂。藥物經(jīng)常規(guī)煎煮、過濾、水浴蒸發(fā),濃縮至分別含生藥 0.7g/mL、1.4g/mL、2.8g/mL的藥液 ,置于 4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 動物模型制備[3]及分組 將實驗大鼠適應性喂養(yǎng) 1周后,隨機抽取 10只作為 A組(正常對照組)。其余大鼠實驗第一天每只腹部皮下注射 40%四氯化碳植物油溶液 0.5mL/100g體重,以后每隔 3d皮下注射 40%四氯化碳植物油溶液 0.3mL/100g體重造模;再以 79.5%單純玉米粉加 20%豬油、0.5%膽固醇制成的混合飼料喂飼;另以 30%乙醇為飲料飼養(yǎng)動物。從第 8周起每周末從造膜大鼠中隨機處死 1只,作肝臟病理學檢查,按照 2000年西安會議《病毒性肝炎防治方案》肝纖維化分期標準判斷肝纖維化程度[4],直到有 2期以上肝纖維化形成,即確定造模成功。造膜結(jié)束死亡大鼠四只,將剩余大鼠隨機分為 5組:B組 ,病理模型組 9只;C組 ,增損甘露消毒丹小劑量組 10只;D組,增損甘露消毒丹中劑量組 10只;E組,增損甘露消毒丹大劑量組 10只;F組,復方鱉甲軟肝片組 10只。治療給藥:A組、B組用生理鹽水灌胃 ,2mL/只,1次 /d,連續(xù)用藥 8周。C組以增損甘露消毒丹 0.7g/100g體重灌胃 ,1次 /d,連續(xù)用藥 8周。D組以增損甘露消毒丹 1.4 g/100g體重灌胃 ,1次 /d,連續(xù)用藥 8周。 E組以增損甘露消毒丹 2.8g/100g體重灌胃,1次 /d,連續(xù)用藥 8周。F組以復方鱉甲軟肝片 0.625g/100g體重灌胃,1次 /d,連續(xù)用藥 8周。

增損甘露消毒丹中劑量組、復方鱉甲軟肝片組大鼠的給藥劑量按成人常用劑量換算。增損甘露消毒丹小劑量組、增損甘露消毒丹大劑量組大鼠的給藥劑量分別按增損甘露消毒丹中劑量組換算所得值的 1/2倍、2倍進行計算[5]。

1.4 觀測指標及檢測方法

1.4.1 一般行為表現(xiàn):精神、活動、皮毛、飲食、糞便等。

1.4.2 常規(guī)病理學檢查:將各組石蠟切片均作常規(guī) HE染色,光鏡觀察肝組織病理變化程度。

1.4.3 免疫組織化學檢測:將各組石蠟切片均作 M MP-1及 TIM P-1免疫組織化學染色,觀察各組大鼠肝組織中 MM P-1及 TIM P-1的分布,并測定其表達。 (SP染色,DAB顯色 ,均按試劑盒說明進行操作)。

2 實驗結(jié)果 2.1 各組大鼠的行為表現(xiàn) 實驗期間正常對照組大鼠飲食、活動及二便無明顯變化,精神狀態(tài)佳 ,皮毛正常有光澤。造模各組動物在注射 CCL4和酒精喂飼期間,所有大鼠均逐漸出現(xiàn)飲食及活動減少,時有稀溏便,個別腹部膨隆,精神不振,反應遲鈍,皮毛凌亂缺乏光澤。各治療組自用藥起,隨著時間的延長總體來說,大便逐漸正常,進食量、攝水量增加,精神狀態(tài)亦隨之好轉(zhuǎn)。除增損甘露消毒丹小劑量組恢復情況一般外,其余各組大鼠均恢復較快。

2.2 各組大鼠肝臟組織 HE染色顯微鏡觀察結(jié)果 正常對照組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)完整,肝細胞大小均勻,肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,小葉內(nèi)肝細胞索排列整齊。病理模型組大鼠肝臟組織的正常結(jié)構(gòu)破壞,肝細胞索排列紊亂,內(nèi)含 2～ 3個中央靜脈或 1個偏在邊緣部的中央靜脈,甚至沒有中央靜脈。小葉結(jié)構(gòu)破壞,肝細胞有濁腫、變性、壞死、脂肪浸潤。匯管區(qū)因纖維結(jié)締組織增生而顯著增寬,其中可見程度不等的炎性細胞浸潤,并有小膽管樣結(jié)構(gòu)(假膽管)。增損甘露消毒丹小劑量組大鼠肝臟組織鏡下觀察結(jié)果與病理模型組基本相似。增損甘露消毒丹中劑量組、增損甘露消毒丹大劑量組、復方鱉甲軟肝片組三個治療組大鼠肝臟組織中均可見到一定程度的細胞變性,肝組織破壞程度、肝細胞壞死及脂肪變的程度均較輕,匯管區(qū)結(jié)締組織增生不甚明顯,總體狀況較病理模型組明顯好轉(zhuǎn)。

2.3 各組大鼠肝組織 MM P-1的檢測結(jié)果 與正常對照組比較,病理模型組顯示肝組織中 MM P-1的表達增多,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。增損甘露消毒丹小劑量組與病理模型組比較,肝組織中 MM P-1的表達,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。增損甘露消毒丹中劑量組、增損甘露消毒丹大劑量組、復方鱉甲軟肝片組三個治療組與病理模型組比較,肝組織中MM P-1表達明顯增多,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。增損甘露消毒丹中劑量組、增損甘露消毒丹大劑量組、復方鱉甲軟肝片組 3個治療組之間比較,肝組織中 MM P-1的表達,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表 1:

表1 肝組織 MM P-1面積 /肝組織面積統(tǒng)計結(jié)果

2.4 各組大鼠肝組織 TIM P-1的檢測結(jié)果 與正常對照組比較,病理模型組顯示肝組織中 TIM P-1的表達明顯增多,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。增損甘露消毒丹小劑量組與病理模型組比較,肝組織 TIM P-1的表達,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。增損甘露消毒丹中劑量組、增損甘露消毒丹大劑量組、復方鱉甲軟肝片組三個治療組與病理模型組比較,肝組織中 TIM P-1的表達明顯降低,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。增損甘露消毒丹中劑量組、增損甘露消毒丹大劑量組、復方鱉甲軟肝片組三個治療組之間比較,肝組織中 TIM P-1的表達,差異無統(tǒng)計學意義(P＞ 0.05)。見表 2。

表2 肝組織 T IMP-1面積 /肝組織面積統(tǒng)計結(jié)果

3 討 論 肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展的必然階段,是由于各種致病因子 (病毒、酒精、寄生蟲等 )引起肝臟的損傷和炎癥導致纖維組織廣泛增生和沉積[7]。其本質(zhì)是由于細胞外基質(zhì)(ECM)合成與降解不平衡,導致 ECM過度沉積。在這個進行性的病理過程中,基質(zhì)金屬蛋白酶(MM Ps)及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑 (TIMPs)起著重要的作用。本實驗選取 MM P-1及TIM P-1這兩個實驗指標進行觀察。MM P-1又稱間質(zhì)膠原酶,屬膠原酶的一種,可將膠原纖維 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型)分解,而肝纖維化時期細胞外基質(zhì)(ECM)主要沉積物為Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原。TIM P-1主要通過兩方面促進肝纖維化發(fā)展:一方面通過抑制膠原酶 (MM P-1,MM P-8,MM P-13等)的降解活性,抑制間質(zhì)性膠原為主的 ECM降解,導致纖維膠原沉積于細胞外;另一方面它可通過抑制激活的 HSC凋亡,從而持續(xù)產(chǎn)生 ECM和大量TIM P-1,如此產(chǎn)生的凈效應導致大量纖維膠原越來越多地沉積于肝細胞外間質(zhì),而不能被膠原酶降解,從而加重纖維化乃至肝硬化[5]。

增損甘露消毒丹是我們經(jīng)長期臨床使用和療效檢驗,治療慢性病毒性肝炎、預防肝纖維化療效肯定的經(jīng)驗方。通過本實驗研究業(yè)已證實,增損甘露消毒丹可以增強肝纖維化大鼠肝組織 MM P-1的表達 ,抑制 TIM P-1的表達 ,從而能夠促進肝內(nèi)ECM的降解,因此對肝纖維化的治療有療效。所以,推測增損甘露消毒丹抗肝纖維化的機理可能是:①能夠增強肝纖維化大鼠肝組織 M M P-1的表達 ,降低 TIM P-1的表達,從而促進肝纖維化的消退;②抑制 HSC的活化,促進 HSC的凋亡,降解 ECM等。

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[4] 陸倫根,曾民德,萬謨彬,等.肝纖維化病理學分級分期及非創(chuàng)傷性診斷檢測關系的初步研究 [J].肝臟,2000,5:194-197.

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[6] 褚云香.MM P-1,TIM P-1及其在肝纖維化中的作用 [J].國際消化雜志,2006,23(10):111-112.

[7] 高春芳,陸倫根.纖維化疾病的基礎和臨床 [M].上海:上海科學技術出版社,2004:265.