日糧能量水平對延邊黃牛肌內脂肪含量與脂聯素表達水平的影響

吉林農業科技學院動物科學學院 張輝 李鵬 閆峰 叢立新 常維毅

舒蘭市獸醫衛生監督所 馬玉杰

舒蘭市水曲柳鎮畜牧站 任寶文

大理石紋是評定牛肉品質的重要因素，其主要取決于肌內脂肪（IMF）含量的高低。脂聯素（ADPN）是脂肪組織基因表達最豐富的蛋白質產物之一，可以調節脂肪代謝，是機體脂質代謝調控網絡中的重要調節因子（Yamauchi等，2001）。本試驗研究了不同能量水平日糧對延邊黃牛不同育肥時期肌內脂肪含量和脂肪細胞因子脂聯素表達的關系，為探討肉牛肌內脂肪沉積相關的主要酶類提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與分組 選取24頭體況中等的健康延邊黃牛，隨機分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三組，每組8頭牛，平均體重約300 kg、平均年齡1.5歲，體重組間差異不顯著（P＞0.05）。經過10 d預試期，逐漸增加精飼料的日喂量，達到設定的營養水平后正式開始前期肥育試驗，肥育試驗共120 d。肥育結束后，每組肉牛全部屠宰，采集主要肌肉塊檢測肌內脂肪含量，同時采集脂肪樣品，用熒光定量法檢測ADPN表達量。

1.2 試驗材料

1.2.1 主要試劑 低熔點瓊脂糖購自BRL公司。Trizol試劑，Gibco公司產品；焦磷酸二乙酯（DEPC）為 Sigma 公司產品，瓊脂糖、Tris、蛋白胨、酵母提取物為TaKaRa公司產品。氯仿、異丙醇、乙醇等均為國產分析純試劑；飽和酚、十二基烷硫酸鈉（SDS）、乙二胺四乙酸鈉（EDTA）等購自長春Biotech公司。標準分子質量DNA Marker DL-2000（分子質量為 2000、1000、750、500、250、100 bp）購自TaKaRa公司。

1.2.2 主要工具酶及宿主菌 T4 DNA連接酶，RNasin購自Promage公司，Ex Taq酶購自TaKaRa公司，反轉錄酶AMV Reverse Transcriptase為NEB公司產品。載體pMD18-T Vector購自TaKaRa公司，JM109宿主菌為本實驗室自制。

1.2.3 主要儀器設備 PCR儀Tpersonal 2000型（Biometra，German）、ABI PRISM 7000 型熒光定量PCR擴增儀（美國ABI公司）；高速冷凍離心機MR18.22型（日本日立）、高速臺式離心機（TGL.16G上海安亭離心機廠）；GeneQuant核酸濃度測定儀（英國 pharmacia Biotech，Ltd 公司）；電泳儀DY-Ⅲ型（北京六一儀器廠）；紫外透射反射分析儀WP型（永嘉上塘儀器廠）；恒溫水浴箱（丹東市醫療器械廠生產）；空氣浴振蕩器（上海智城ZHWY-103D）；數顯不銹鋼鼓風干燥箱；脂肪測定儀（SZF-06A上海新嘉電子有限公司）。

1.3 日糧組成與飼養管理 分別給Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組試驗牛飼喂三個水平能量比的日糧。粗料為玉米秸桿，每頭牛單圈單槽飼喂，每天自由采食。各組試驗牛日糧組成及營養水平見表1。

1.4 樣品采集 分別于19、20、21月齡和 22月齡，采集牛尾部脂肪樣品500 mg，存于液氮中備用。采集胴體胸肉、腰肉、眼肉、腱子肉、上腦等主要部位肌肉各300 mg，冷凍備用。

1.5 測定指標 不同肌肉內脂肪含量為肌肉干物質中脂肪所占百分比，采用索氏浸提法進行測定。同時測定日增重、屠宰前活重、胴體重和屠宰率；脂肪樣品中ADPN mRNA的表達水平采用熒光定量RT PCR法進行測定。

1.6 脂肪組織ADPN mRNA水平的檢測

1.6.1 脂肪細胞總RNA的提取及總RNA的反轉錄 脂肪細胞總RNA的提取采用Trizol兩步法，具體操作按說明進行。在DNA/RNA定量儀上測定RNA濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA條帶的完整性。根據測定的濃度，將各樣品RNA用DEPC水調節成同一水平，采用AMV反轉錄酶，以相同體積的總RNA為模板，以Oligo-dT為引物進行RT反應。取1 μL RT產物進行Real-time PCR反應，得出在相同RNA水平上各樣品的ADPN mRNA拷貝數。

表1 不同能量配比育肥牛日糧組成及營養水平

1.6.2 陽性標準品質粒的制備

1.6.2.1 ADPN引物設計：根據Genbank中查閱出ADPN序列，利用Primer Express 2.0設計軟件，分別設計以下引物（上海基康生物工程公司合成），見表 2。

表2 試驗所用ADPN引物和探針

1.6.2.2 陽性標準品的質粒的制備：屠宰采集的脂肪100 mg提取總RNA反轉錄制備成cDNA，常規PCR。電泳后用凝膠試劑盒回收，連接到PMD18-T載體，轉化大腸桿菌感受態細胞，克隆后提取質粒，進行重組質粒的PCR和雙酶切鑒定。將鑒定正確的陽性克隆送上海生工進行序列測定。

1.7 熒光定量RT-PCR方法 采用Pharmacia Biotech公司的RNA/DNA calculator，在260 nm下測定質粒的純度及濃度后，用滅菌四餾水分別做101、102、103、104、105、106、107、108、109稀 釋 分 別 作為熒光定量PCR反應的陽性標準模板，每個水平設3個重復，設3個陰性質控（NTC）。PCR體系為（25 μL）：ddH2O 16.2 μL；10×Taq-buffer 2.5 μL；dNTPs Mixture（各 2.5 m mol/L）2.0 μL；上游引物（12 pmol/μL）、下游引物（12 pmol/μL）、探針（15 pmol/μL） 各 1.0 μL；Ex Taq 酶（1 U/μL）0.3 μL；temperate DNA 1.0 μL。反應條件為：先95℃預變性3 min，然后按95℃變性15 min，60℃退火1min，共計50個循環。反應在ABIPRISM 7000型熒光定量PCR擴增儀（美國ABI公司）上進行。所有反應信息資料被ABI PRISM 7000型熒光定量PCR擴增儀收集并儲存于其附件電腦（含相應的分析軟件）中，反應結束后根據陽性定量標準模板的擴增情況自動繪制標準曲線。

1.8 數據統計分析 所有數據均以平均值±標準差表示，用SPSS 10.0軟件進行分析，組間差異顯著性用ONE-WAYANOVA方差分析進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 對生產性能和優質切塊肌肉脂肪含量的影響 見表3和表4。

表3 對育肥牛生產性能的影響

表3結果顯示Ⅲ組較Ⅰ、Ⅱ組育肥末期體重、日增重、胴體重和屠宰率顯著增加（P＜0.05），Ⅰ組與Ⅱ組間差異不顯著（P＞0.05）；與Ⅰ組和Ⅱ組相比，Ⅲ組胴體脂肪重、背膘厚度和非胴體脂肪均顯著增加（P＜0.05），Ⅰ組與Ⅱ組間差異不顯著（P ＞ 0.05），本試驗結果與陳宇等（2006）和杜瑋（2007）試驗結果相一致。

表4 對育肥牛優質切塊肌內脂肪含量的影響 %

表4結果顯示，主要肌塊肌內脂肪含量除腱子肉、上腦肉外，Ⅲ組顯著高于Ⅰ、Ⅱ組（P＜0.05），Ⅰ組與Ⅱ組間差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 對ADPN mRNA水平的影響 延邊黃牛不同育肥時期ADPN mRNA水平的影響見表5。

由表5可見，19～22月齡，Ⅲ組ADPN mRNA水平均顯著高于Ⅰ、Ⅱ組（P＜0.05），但Ⅰ組與Ⅱ組間差異不顯著（P＞0.05）；不同月齡間，試驗Ⅰ組與Ⅱ組ADPN mRNA水平21月齡和22月齡兩個階段均顯著高于19月齡和20月齡（P＜0.05）；試驗Ⅲ組ADPN mRNA水平隨月齡增加而顯著增加（P＜0.05）。經相關分析檢驗，不同處理組，延邊黃牛脂肪組織ADPN mRNA水平與肌內脂肪含量呈正相關關系（n=8）：Ⅰ組y=3.86+2x（r=0.52；P ＜ 0.001）、 Ⅱ組 y=3.75+2.38x（r=0.61；P ＜0.001）、Ⅲ組 y=5.92+0.53x（r=0.72；P ＜ 0.001）。

表5 對ADPN mRNA水平的影響

3 討論

近年來，研究人員根據不同的目的，利用基因工程手段對脂聯素基因進行了克隆表達和基因敲除，對ADPN的生物學功能及研究不斷深入。Wang等（2004）發現ADPN mRNA在豬脂肪組織細胞中表達豐富。張國棟（2004）等還對豬脂聯素進行了成功定位。Sreenivasa等（2005）發現，雞脂聯素基因在脂肪組織中表達量最高，其次是肝臟、腺垂體、間腦、腎臟和骨骼肌，提示其可能在體內發揮與哺乳動物不一樣的生物學功能。Fu等（2005）研究發現，在3T3-L1脂肪前體細胞分化為脂肪細胞的過程中，經基因轉染而表達的ADPN，通過自分泌作用促進了脂肪細胞脂質積聚。但有關脂聯素基因在肉牛上的研究鮮見報道。

張輝等（2007）研究表明，脂聯素基因在荷斯坦新生犢牛脂肪前體細胞中低表達，脂肪細胞內甘油三酯隨脂肪前體細胞分化成熟逐漸蓄積，ADPN mRNA也逐漸升高，在第12天表達最高，提示脂聯素基因的表達與脂肪細胞的分化和脂質積聚有著密切的關系。本試驗研究發現，延邊黃牛脂肪組織ADPN mRNA水平與肌肉脂肪含量呈正相關關系，驗證了上述研究。

4 結論

本試驗結果表明：（1）高能日糧能提高延邊黃牛脂肪組織的ADPN mRNA水平，飼喂同一能量水平日糧，ADPN mRNA水平有隨著育肥日齡增加而增加趨勢。（2）延邊黃牛脂肪組織ADPN mRNA水平與肌內脂肪含量呈正相關關系（P<0.001）。

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