免疫親和柱-高效液相色譜法檢測青貯飼料中的嘔吐毒素

中國農業科學院飼料研究所 董穎超 李 俊 李軍國 牛力斌

青貯飼料是指經人工調劑的多汁青飼料，多用于反芻動物的冬春季節飼喂，對泌乳奶牛尤為重要。李春杰等（2009）認為，在青貯過程中導致青貯飼料受霉菌毒素的污染主要有以下兩個原因：一是青貯原料在貯前已被霉菌污染，二是由于青貯制作中水分含量低于70%，水分不足不僅影響乳酸菌微生物的發酵，而且使空氣難以排凈，引起了霉變。奶牛進食受霉菌毒素污染的飼料后，不僅會影響奶牛的生產性能，而且還影響原料奶的安全性，造成奶牛養殖業的經濟損失，因此有必要建立檢測方法以便監控奶牛青貯飼料中霉菌毒素的污染狀況。

嘔吐毒素（deoxynivalenol，DON）又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，是霉菌毒素的一種，可導致動物腸功能紊亂（腹瀉、嘔吐），口腔黏膜和真皮損傷，免疫力下降（孟昭赫，1990）。目前用于檢測DON的方法主要有酶聯免疫吸附（ELISA）法、薄層層析（TLC）法和高效液相色譜（HPLC）法。ELISA法重現性差，假陽性問題嚴重，TLC法對環境和操作人員的污染較大，而HPLC法具有靈敏性高，檢測時間短等優點。目前鮮見檢測青貯飼料中DON的檢測方法報道，本研究旨在通過建立青貯飼料中檢測DON的液相色譜法，為進一步掌握青貯飼料中DON的污染水平提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料 奶牛用玉米青貯飼料樣品1、2分別取自天津某公司和天津某奶牛養殖場。

1.2 試劑 甲醇（色譜純），購自Thermo-Fisher公司；純水，18MΩ，取自 Millipore系統；DONtest HPLC免疫親合柱，購自北京中檢維康Vicom公司；聚乙二醇8000，購自北京化學試劑公司；嘔吐毒素（純度 ≥ 98%），購自Sigma-Aldrich公司；GM200均質機，德國Retsch公司；EYELA MG2200型氮吹儀，日本精工公司。

1.3 色譜條件 液相系統為Agilent 1100系列，配可變波長檢測器（VWD），色譜柱為Eclipse XDB C18反相柱（4.6 mm×150 mm i.d.，5 μm）；進樣量為 50 μL；流動相為 15∶85（V/V）的乙腈水溶液；流速為 1.0 mL/min；等度洗脫；檢測波長220 nm。

1.4 樣品處理方法 將青貯飼料樣品于-20℃冰箱內冷凍保藏，檢測前于100℃烘箱內烘干2 h后，粉碎，過20目篩，加入一定量聚乙二醇8000，200 mL提取液，Retsch磨 5000 r/min下高速均質2 min后，過微纖維濾紙，取一定量濾液，過經純水沖洗的免疫親和柱，用一定量色譜級甲醇淋洗柱子，將樣品淋洗液，氮氣吹干，用1 mL甲醇定容，上機測定。

2 結果與討論

2.1 提取條件的優化 為充分提取樣品中的DON，采用的溶劑組合為甲醇水溶液體系，分別以純水、甲醇-水（V/V，20∶80）、甲醇-水（V/V，40∶60）的混合液作為提取液，其他條件不變，考察不同提取液對提取效果的影響。結果發現，提高提取液中甲醇的比例，DON的回收率會略微降低，但混合液中水的比例高時會淋洗出更多的雜質，導致基線噪音加大，干擾測定。綜合考慮選擇甲醇-水（V/V，20∶80）作為樣品提取液。圖1為濃度為1.0 mg/L的DON標準品的高效液相色譜圖，故將樣品1、2的添加水平設為1.0 mg/kg進行檢測，色譜圖見圖2。

圖1 標準嘔吐毒素的高效液相色譜圖（1.0 mg/L）

2.2 線性范圍 上述測定條件下，發現濃度在0.1～5.0 mg/L時，DON 的質量濃度（X，mg/L）與峰面積（Y）呈良好的線性關系，嘔吐毒素的工作曲線見圖3。DON的線性回歸方程為

圖2 樣品的高效液相色譜圖（1.0 mg/kg）

Y=-0.41581+58.89623X，R2=0.9997。

圖3 嘔吐毒素工作曲線

2.3 檢出限 以S/N=3為判定標準，青貯飼料中的嘔吐毒素的檢測限可以達到0.05 mg/L。

2.4 回收率與精密度實驗 結果見表1，在青貯飼料樣品 1中添加 0.5、1.0、2.0 mg/kg的 DON，測得回收率為82% ～117%，相對標準偏差（RSD）為5.1%～7.8%。

表1 青貯飼料中嘔吐毒素回收率實驗結果

3 結論

本實驗結果表明：（1）本方法中DON的質量濃度在0.1～5.0 mg/L，與其峰面積呈良好線性關系，相關系數為R2=0.9997；（2）青貯飼料樣品通過免疫親和柱處理后，能夠有效的去除基質的干擾，具有較好的回收率（82%～117%），本法可用于測定青貯飼料中DON。

[1]李春杰，李長勝，孫雙.玉米青貯HACCP技術與青霉菌污染防治[J].農業系統科學與綜合研究，2009，25（3）：361 ～364.

[2]孟昭赫.食品衛生學檢驗方法注解，微生物學部分[M].北京：人民衛生出版社，1990.28.