克羅卡林對急性腦缺血再灌注大鼠的腦保護作用

馮 濤 婁季宇 白宏英 楊霄鵬 曾志磊 王金蘭

鄭州大學第二附屬醫院神經內科 鄭州 450014

腦缺血再灌注后損傷是引起缺血性腦血管病（ischemic cerebrovascular disease，ICVD）腦功能損害的重要原因。已知很多因素參與再灌注后損傷的過程，其中炎癥反應促進了繼發性腦損傷。小膠質細胞（microglia，MG）是腦內的主要免疫效應細胞，生理狀況下它對維持腦內環境穩態起重要作用，當腦內發生病理損害時迅速激活產生大量神經毒性因子，加速神經元的死亡。K－ATP通道開放劑Cromakalin以細胞內的ATP/ADP水平為門控因素、非電壓依賴性的特殊鉀離子通道，廣泛存在中樞神經系統內。它的激活是機體缺血缺氧狀態下的自我保護機制，可以對抗損害因子對機體的傷害，若早期用開放劑打開這類通道，可以減輕腦缺血缺氧對神經元的損害。

本研究旨在利用大鼠MCAO模型，觀察大鼠急性腦缺血再灌注后海馬區CA1區OX42、iNOS的表達情況，神經元特異性尼氏染色法檢測神經元數目及Cromakalin干預后的變化，為K－ATP通道開放劑盡早應用于臨床治療ICVD提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器SD大鼠由鄭州大學實驗動物中心提供。圖像采集：德國Lecia顯微照像系統。Cromakalin，Sigma美國。分析系統：上海山富科學儀器有限公司，Biosens Digital Imaging。System v1.6。OX42、iNOS抗體：北京中杉生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組：72只雄性SD大鼠，體質量（220±30）g隨機分為3組：A組為假手術組，B組為單純缺血再灌注組，C組為克羅卡林干預組，每組24只分6h、24h、72h、7d時間點，每個時間點各6只。

1.2.2 動物模型制備：應用改良Zea Longa線栓法制備大鼠MCAO模型。大鼠蘇醒后參照Zea Longa 5分制標準［1］進行神經行為學評分，1～3分動物入選。

1.2.3 動物處理：C組在MCAO后2h給予Cromakalin 0.4mg/（kg·d），2mL腹腔注射，B組在MCAO后2 h給予生理鹽水2 m L腹腔注射，A組除了不插入線栓其他同B組。達各時間點后，用10％水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，用生理鹽水和4％多聚甲醛進行心臟灌注固定，取腦，制作腦部冠狀石蠟切片（厚度4μm）。采用免疫組化染色（SP法），檢測CA1區OX42、iNOS的表達情況。各組取7d時間點進行海馬CA1區神經元尼氏染色，每組取6張切片，在400倍視野下計數神經元。

1.3 統計學方法實驗的數據采用均數±標準差（±s）表示，應用SPSS10.0統計軟件對實驗數據進行統計分析，多組均數間的比較采用單因素方差分析（one－way，ANOVA），均數間的兩兩比較采用LSD檢驗，以α＝0.05作為顯著性檢驗水準。

2 結果

2.1 海馬CA1區OX42的表達情況A組、B組、C組各時間點海馬CA1區OX42均有表達，A組4個時間點OX42變化不明顯，B、C兩組OX426h開始表達，24 h明顯增多，72h達高峰，7d仍有表達，明顯高于A組各時間點（P＜0.05），C組時間點表達均少于B組（P＜0.05）。結果見表1。

表1 各時間點海馬CA1區OX－42的平均積分光密度的變化±s）

表1 各時間點海馬CA1區OX－42的平均積分光密度的變化±s）

注：▼與 A組相比，P＜0.01；▽與B組相比，P＜0.01

組別6 h 24 h 72 h 7 d A組 95.93±3.03 102.08±4.26 106.27±8.32 100.39±2.92 B組 131.76±5.19▼ 155.73±6.49▼ 174.77±8.09▼147.14±11.87▼C組 118.64±6.36▼▽140.13±4.35▼▽144.13±5.51▼▽123.93±8.47▼▽

2.2 海馬CA1區iNOS表達情況A組、B組、C組各時間點海馬CA1區iNOS均有表達，A組4個時間點iNOS變化不明顯，B、C兩組6 h開始表達，24 h明顯增多。72 h達高峰，7 d仍有表達，明顯高于A組各時間點（P＜0.05）。C組各時間點表達均少于B組（P＜0.05）。結果見表2。

表2 各時間點海馬CA1區iNOS的平均積分光密度的變化±s）

表2 各時間點海馬CA1區iNOS的平均積分光密度的變化±s）

注：▼與A組相比，P＜0.01；▽與B組相比，P＜0.01

組別6 h 24 h 72 h 7 d A組 93.52±4.16 100.24±6.84 103.38±4.88 98.50±3.72 B組 127.47±3.77▼ 161.97±8.29▼170.86±10.21▼ 146.66±5.97▼C組 115.05±8.27▼▽133.64±7.59▼▽142.43±4.82▼▽121.60±5.97▼▽

2.3 海馬CA1區神經元變化情況A組神經元（60.66±6.62）個，B組神經元（11.50±3.08）個，即在大鼠缺血再灌注7d時，海馬CA1區神經元的死亡數目是原有數目的81.1％，存活數目是原有數目的18.9％。C組神經元（29.33±4.88）個，即在大鼠缺血再灌注7d時，海馬CA1區神經元存活數目是原有數目的48.4％，即保護了29.5％的神經元免于死亡。三組之間差異有明顯統計學意義（P＜0.05），結果見表3。

表3 神經元尼氏染色±s，個/400倍視野）

表3 神經元尼氏染色±s，個/400倍視野）

注：▼與A組相比，P＜0.01；▽與B組比，P＜0.01

組別 n 神經元數目A組6 60.66±6.62 B組 6 11.50±3.08▼C組 6 29.33±4.88▼▽

3 討論

近些年來隨著影像學在神經科的廣泛應用，特別是頭顱MRI及DWI在臨床的廣泛應用，急性腦梗死后2h內即可在影像學上發現缺血病灶，為臨床上早期溶栓治療提供了可靠的依據，腦缺血再灌注損傷也是不能避免［2］。再灌注損傷涉及到多個病理生理環節，其中炎癥反應促進了繼發性腦損，是缺血再灌注損傷的重要原因之一。在哺乳動物中，海馬CA1區神經元是腦部缺血容易損傷的區域之一，所以海馬CA1是研究者經常選擇觀測腦部病理變化的區域之一。

MG在顱內分布比較廣泛，是顱內的主要免疫效應細胞，大約占膠質細胞的5％～20％［3］。在生理狀態下對神經元有營養、支持、保護等重要作用，對顱內環境有免疫監視和宿主防御的作用。同時MG對顱內的內環境改變及其敏感，特別是感染和創傷時迅速被激活，形態上由靜息時的分支狀到活化的阿米巴樣，細胞胞體增大，并產生大量的神經毒性因子，對神經元產生毒性作用，加重對腦部的損害。因此抑制MG的過度激活，具有腦保護作用。另激活的MG是iNOS的主要來源。iNOS是人體內一種重要的合酶，在生理條件下并不表達，只在病理情況下如腦缺血再灌注損傷時，iNOS可以出現在炎性細胞、神經元、神經膠質細胞及微血管內皮細胞中，一旦誘導合成，就持續大量產生一氧化氮（NO）。NO是一種化學性質活潑的自由基，兼有細胞毒性作用，過量持續的表達是腦缺血再灌注損傷的一個重要因素，因此iNOS是腦缺血再灌注損傷產生過量NO的基礎。

K－ATP通道是1983年Noma［4］首先發現存在于豚鼠心肌細胞膜上，現已經證明它也廣泛存在中樞神經系統中，同樣也存在小膠質細胞上。在正常生理狀態下腦內的K－ATP通道處于關閉狀態，當機體出現缺血缺氧、炎癥反應等時，KATP通道開放，鉀離子大量外流，細胞出現超極化狀態，神經元的興奮性降低，調節鈣離子的平衡，穩定線粒體膜電位，抑制凋亡等，是機體的一種重要自我保護機制。本實驗觀察應用K－ATP通道開放劑Cromakalin干預大鼠腦缺血再灌注后不同時間點OX42、iNOS表達的變化，發現應用Cromakalin干預后，OX42、iNOS的表達明顯低于腦缺血再灌注組，海馬CA1區神經元存活數目Cromakalin干預組明顯多于非干預組。說明K－ATP通道開放劑Cromakalin可通過抑制小膠質細胞的過度激活、iNOS的過度表達，保護腦缺血大鼠海馬CA1區神經元遲發性死亡等方面保護神經元，從而起到腦保護的作用。

［1］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（l）：84－91.

［2］李建章，主編.神經科醫師手冊［M］.北京：人民衛生出版社，2010：161－183.

［3］彭玲梅，黃泳.小膠質細胞在阿爾茨海默病炎性反應中的雙重作用［J］.醫學綜述，2009，15（19）：2 889－2 890.

［4］Noma A.ATP－regulated K＋channels in cardiac muscle［J］.Natuer，1983，305（5930）：147－148.