丁苯肽對血管性癡呆大鼠學習記憶障礙的實驗研究

王欣東 陳淅泠 李秋霞 張曉峰

鄭州大學第二附屬醫院 鄭州 450014

血管性癡呆是由不同腦血管病變所致，以學習記憶障礙為主要臨床表現的慢性獲得性嚴重認知功能障礙綜合征，為腦血管疾病常見后遺癥之一，給患者家庭帶來很大困擾。丁苯肽是我國開發的抗腦缺血新藥，可從多個環節起到抗腦缺血作用。丁苯肽對血管性癡呆學習記憶障礙是否有治療作用，目前報道不多。我們擬采用血管性癡呆大鼠動物模型，探討丁苯肽在血管性癡呆中的治療作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑與器材 健康雄性Wister大鼠42只，體質量（400±20）g（鄭州大學實驗動物中心購買），丁苯肽（石藥集團恩必普藥業有限公司提供），MG－2－Y型迷宮（張家港市生物醫學儀器廠），P38 MAPK特異性抗體（北京博奧森公司，兔源，對大鼠P38MAPK特異），iNOS特異性抗體（美國Santa Cruz公司，兔源，對鼠iNOS特異），SP9000試劑盒（北京中杉生物工程公司），TUNEL試劑盒及DAB顯色劑（北京博奧森公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物的分組、模型制作及給藥方法：大鼠在試驗動物房適應性飼養1周后，隨機把42只大鼠分到假手術組，模型組，丁苯肽組。3組大鼠均用10％水合氯醛（3.5 mg/kg）腹腔內注射麻醉，成功后沿頸部正中縱向切開皮膚，鈍性分離開皮下筋膜及肌肉組織至雙側頸總動脈，模型組與丁苯肽組每側頸總動脈用0號手術絲線雙結扎，從中間剪斷，縫合手術切口。術后保暖，待蘇醒，放回清潔籠箱繼續飼養。假手術組除不結扎外，亦按上述手術過程操作。術后2周，丁苯肽治療組按65mg/（kg·只），植物油稀釋成2mL給于丁苯肽灌胃，模型組與假手術組僅分別給于2mL植物油，3組均1次/d，連續2月。

1.2.2 Y－型迷宮試驗：在光線暗的房間中且周圍安靜境況下進行試驗，先將大鼠放入起步區（大鼠開始所在臂）適應5 min，當安全區信號燈亮起5 s后給起步區與非安全區加電，而安全區不給加電，當大鼠被電擊后跑至安全區為一次訓練完成。電擊后大鼠直接跑至安全區為正確反應。上一次結束后原來的安全區5 s后變為下一次訓練的起步區，重復上一次過程。安全區與電擊區的位置按順時針變換，測10次休息5 min，用10次中連續出現9次正確反應前所需的電擊次數代表大鼠學習能力強弱。24 h候后，每個大鼠測10次，以正確反應次數代表記憶能力強弱。

1.2.3 免疫組化及Tunel染色：迷宮試驗后，將大鼠麻醉，成功后迅速打開胸腔，在右心房剪開一小口，迅速用5 mL針頭刺入左心室，快速注入生理鹽水，待右心房流出的液體不再含血液后迅速斷頭取腦，把海馬與其他腦組織分離后放入4％甲醛內固定24 h，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，冠狀方向切片（厚約5μm），每只大鼠隨機取3張切片分別進行p38 mapk、iNOS免疫組化檢測及Tunel染色（嚴格按說明書進行）。

1.2.4 圖像采集、分析及統計學處理：每張切片選取面積大致相同的3個視野，用德國Lecia顯微照像系統和Biosens Digital Imaging System v1.6系統，測定灰度值及計算細胞凋亡百分比，取三視野平均值做為該切片最后結果，做為該大鼠觀測值。數據均用均數±標準差±s）表示，用SPSS17.0統計軟件，單因素方差分析，組間用LSD法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠學習記憶能力（次數）比較 見表1。

表1 3組大鼠學習、記憶能力±s）

表1 3組大鼠學習、記憶能力±s）

注：與假手術組比較，△P＜0.05；與模型組比較，○P＜0.05

組別 n 學習 記憶假手術組14 34.07±3.09 8.07±1.07模型組 14 74.21±3.01△ 4.64±1.49△丁苯肽組 14 60.78±4.26○ 6.42±1.45○

2.2 3組大鼠海馬區p38 MAPK、iNOS陽性區平均灰度值及細胞凋亡百分比比較 見表2。

表2 3組大鼠海馬區p38 MAPK、iNOS陽性區平均灰度值及細胞凋亡百分比±s）

表2 3組大鼠海馬區p38 MAPK、iNOS陽性區平均灰度值及細胞凋亡百分比±s）

注：與假手術組比較，△P＜0.05；與模型組比較，○P＜0.05

組別n p38MAPK iNOS 凋亡百分比假手術組14 10.20±2.32 7.07±2.33 5.07±2.40模型組 14 70.72±4.81△72.51±4.80△61.92±4.19△丁苯肽組14 65.02±4.14○67.11±4.15○35.00±3.32○

3 討論

學習記憶障礙是血管性癡呆常見癥狀。學習記憶在腦內有一定功能區域位，該位置損害常引起學習記憶障礙。海馬是與學習記憶有密切關系的主要功能區，在缺血情況下極易損傷，為缺血易損區之一［1］，損傷后常引起學習記憶障，近來研究認為海馬缺血性損傷為血管性癡呆的病理基礎［2］。研究發現，血管性癡呆動物海馬區存在iNOS和p38MAPK高表達［3－4］。而iNOS是NO合成酶之一，在正常情況下不表達或極少量表達，在缺血缺氧等應激時持續表達，合成過量NO；過量NO可引發細胞凋亡［5］，引起認知障礙［6］。p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶信號轉導通路中的重要分子，p38MAPK不僅與炎癥等密切相關，還參與細胞的凋亡過程，缺血缺氧狀態下其表達增多且被激活后可調節Bc1－2［7］以及bax流入線粒體［8］，引起神經細胞凋亡，造成學習記憶減退［9］。

在本實驗中，我們借助免疫組化法對3組大鼠海馬區p38MAPK及iNOS的表達情況做一檢測，發現模型組大鼠的確存在著明顯表達，這與以往研究結果基本一致。在丁苯酞組中，二者也存在著表達，但明顯低于模型組（P＜0.05），與假手術組相比，其表達仍然是高的（P＜0.05）。3組大鼠海馬細胞凋亡百分比以模型組最高，丁苯肽組次之，假手術組最低（P＜0.05）。3組大鼠學習記憶能力比較，發現丁苯肽組雖不及假手術組，但較模型組明顯增強，3組兩兩比較均有明顯統計學意義（P＜0.05）。

綜上所述，我們認為丁苯肽可以用來對血管性癡呆學習記憶障礙的治療，具體可能是通過降低了iNOS及p38MAPK的表達，減少了海馬參與學習記憶細胞的凋亡，從而改善血管性癡呆學習記憶認知障礙，但其具體如何引起iNOS與p38MAPK表達降低有待研究。

［1］Burda J，Matiasova M，Gottlieb M，et al.Evidence for a role of second path physiological stress in prevention of delayed neuronal death in the hippocampal CA1 region［J］.Neurochemres，2005，30（11）：1 397－1 405.

［2］劉斌，姜敏，張晉霞.急性腦梗塞患者認知障礙的臨床特征分析［J］.山東醫藥，2009，49（33）：.

［3］鄧醫宇，曾紅科.誘導型一氧化氮合酶在血管性癡呆大鼠海馬中的表達［J］.中華急診醫學雜志，2004，13（17）：606－608.

［4］王雪笠，呂佩源.血管性癡呆小鼠海馬p38 MAPK的表達及其意義［J］.中國神經精神疾病雜志，2008，34（2）：83－86.

［5］Elibol B，Soylemezoglu F，Unal I，et al.Nitric oxide is Involved in ischemia－induced apoptosis in brain：a study in neuronal nitric oxide synthase nullmice［J］.Neuroscience，2001，105（1）：79－86.

［6］Nomura Y.Neuronal apoptosis and protection：Effects of nitric oxide and endoplasmic reticulum－related proteins ［J］.Biol Pharm Bull，2004，27（7）：961－963.

［7］王玉，孫黎光.在Fas誘導Bel－7402細胞凋亡中p38MAPK調節Bcl－2的表達［J］.世界華人消化雜志，2007，15（30）：3 184－3 189.

［8］Ghatan S，Lamer S，Kinoehita Y，et al.p38 MAP kinase mediates bax translocation in nitric oxide－induced apoptosis in neurons［J］.J Cell Biol，2000，150（2）：335－347.

［9］Wang T，Liu CZ，Yu JC，et al.Acupuncture protected cerebral multi－infarction rats from memory impairment by regulating the expression of apoptosis related genes Bcl－2 and Bax in hippocampus［J］.Physiol Behav，2009，96（1）：155－161.