白介素-4和免疫球蛋白E含量指標在快速檢測藥物引起過敏反應中的作用研究Δ

肖貴南，盛英美，陳浩桉，李建定

（1.廣東省藥品檢驗所，廣州市 510180；2.中山大學中山醫學院，廣州市 510089）

藥物注射劑引起的過敏反應呈逐年增加的趨勢，而其檢測方法主要參照2005年版《中國藥典》規定的豚鼠過敏反應檢查法，存在檢驗周期偏長（2～3周）、直接觀察過敏反應指標（豎毛、咳嗽、噴嚏等）不夠客觀等缺陷[1]。本文以經過常規過敏反應檢查法證實能引起過敏的中藥注射劑及生化制劑為例，通過建立連續靜脈注射致敏方法，探討檢測血清中白介素-4（IL-4）和免疫球蛋白E（IgE）抗體在快速判斷藥物引起的過敏反應中的可行性，并與常規法定方法進行比較，為藥物引起的過敏反應提供一種新型的快速檢測途徑。

1 材料

1.1 試藥

清開靈注射液（吉林某藥廠生產，批號：090118-6，規格：每支10 mL）；香丹注射液（浙江某藥廠生產，批號：080524，規格：每支10 mL）；腦蛋白水解物注射液（吉林某藥廠生產，批號：081201，規格：每支5 mL）；喘可治注射液（廣州健心藥業有限公司生產，批號：20071102，規格：每支2 mL）；馬血清（廣州蕊特生物科技有限公司生產，批號：090318，規格：每瓶100 mL）；生理鹽水（昆明市宇斯藥業有限公司生產，批號：08070204，含量：9 g·L－1，規格：每瓶100 mL）；IL-4和總IgE測定試劑盒（深圳晶美生物工程有限公司）。

1.2 動物

Hartery品系的豚鼠，♀♂各半，體質量：280～320 g，購自廣東省醫學實驗動物中心，合格證號：2008A0026。

1.3 儀器

Elx808酶標儀（美國Bio-Tek公司）。

2 方法

2.1 馬血清引起IL-4和總IgE水平升高及過敏反應的時效性

取豚鼠32只，按攻擊時間不同分為4組（d 7、d 8、d 9、d 10攻擊組），每組8只，♀♂各半，各組豚鼠均分別于d 0、d 1、d 2靜脈注射10%馬血清0.5 mL進行致敏，共注射3次，分別對應于d 7、d 8、d 9、d 10各組取全部豚鼠8只，從豚鼠足背中靜脈取血1 mL，3000 r·min－1離心15 min，分離血清測定IL-4和總IgE。取血后的各只豚鼠再從陰莖背靜脈注射1次馬血清1.0 mL進行攻擊，觀察并記錄豚鼠整體過敏反應的發生情況。另取未經任何處理的豚鼠8只作為空白組，取靜脈血離心分離血清，以酶聯免疫吸附（ELISA）法測定空白IL-4和總IgE。

2.2 靜脈注射藥物引起IL-4和總IgE水平升高及過敏反應的快速檢查

取豚鼠40只，♀♂各半，隨機分為5組：生理鹽水組、清開靈注射液組、香丹注射液組、腦蛋白水解物注射液組、喘可治注射液組，每組8只，♀♂各半，各組豚鼠分別于d 0、d 1、d 2靜脈注射上述供試品原液0.5 mL，每只豚鼠共注射3次進行致敏，并于d 8從豚鼠足背中靜脈取血1 mL，分離血清，測定IL-4和總IgE。再從陰莖背靜脈注射相應供試液1.0 mL進行攻擊，觀察并記錄豚鼠整體過敏反應的發生情況。

2.3 藥物腹腔注射過敏反應檢查方法及IL-4和總IgE水平的測定

取豚鼠隨機分為6組：生理鹽水組、馬血清組、清開靈注射液組、香丹注射液組、腦蛋白水解物注射液組、喘可治注射液組，每組12只，馬血清濃度為10%，各組豚鼠分別于d 0、d 2、d 4腹腔注射相應供試液0.5 mL進行致敏。于d 14、d 21時，每組分別各取6只豚鼠從足背中靜脈取全血1 mL，分離血清測定IL-4和總IgE水平。取血后的各組6只豚鼠再從陰莖背靜脈注射相應供試液1.0 mL進行攻擊，觀察并記錄豚鼠整體過敏反應的發生情況。

2.4 ELISA法測定血清IL-4和總IgE水平

血清存放于－30℃冰箱中，1月內進行IL-4和總IgE水平的測定；采用雙抗夾心ELISA法，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

2.5 豚鼠過敏反應的判斷

參照2005年版《中國藥典》附錄的標準，觀察豚鼠注射供試液進行攻擊后30 min內有無噴嚏、抽搐、休克等過敏反應發生。如豚鼠發生豎毛、噴嚏、干嘔、連續咳嗽3聲和呼吸困難等現象中的2種或2種以上，或出現抽搐、休克、死亡現象之一者，判為過敏反應陽性。

2.6 數據處理與統計

3 結果

3.1 馬血清引起IL-4和總IgE水平升高及過敏反應的時效性

豚鼠整體實驗情況：連續3 d靜脈注射致敏后，d 7攻擊的8只豚鼠中有5只出現過敏反應陽性結果（3只死亡），d 8及以后各組8只豚鼠均在攻擊后5 min內出現過敏反應陽性結果（每組有4只豚鼠死亡）。

空白組豚鼠血清的IL-4和總IgE水平分別為（92.4±11.8）ng·L－1（n＝8）、（43.3±6.3）IU·mL－1（n＝8）。血清中IL-4和總IgE水平結果見表1。

表1 馬血清引起IL-4和總IgE水平升高的時效性實驗結果（±s，n＝8）Tab 1 The time-effectiveness of the increase of IL-4 and IgE caused by horse serum（±s，n＝8）

表1 馬血清引起IL-4和總IgE水平升高的時效性實驗結果（±s，n＝8）Tab 1 The time-effectiveness of the increase of IL-4 and IgE caused by horse serum（±s，n＝8）

與空白組相應的指標比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.relevant index of blank group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

由表1可見，注射馬血清進行致敏后，豚鼠血清IL-4和總IgE水平在d 7時開始升高（P＜0.05），d 8起出現急劇升高（P＜0.01），與空白組的相應指標相比，均有顯著性差異。

上述整體實驗及ELISA法測定結果提示：連續3 d靜脈致敏后的d 8起，豚鼠可出現明顯的過敏反應和IL-4及總IgE水平升高，因而以下靜脈致敏的過敏反應檢查均以d 8為準，以此反映過敏反應的出現時間。

3.2 靜脈注射藥物引起IL-4和總IgE水平升高及過敏反應的快速檢查

豚鼠整體實驗情況：靜脈致敏d 8后，除了生理鹽水組和喘可治注射液組豚鼠未出現過敏反應外，其余各組8只豚鼠均出現了過敏反應陽性結果。

血清中IL-4和總IgE水平測定結果見表2。

表2 靜脈注射致敏藥物d 8時各組豚鼠血清中IL-4和總IgE水平（±s，n＝8）Tab 2 Serum level of IL-4 and IgE of guinea pigs 8 days after intravenous administration of allergic agents（±s，n＝8）

表2 靜脈注射致敏藥物d 8時各組豚鼠血清中IL-4和總IgE水平（±s，n＝8）Tab 2 Serum level of IL-4 and IgE of guinea pigs 8 days after intravenous administration of allergic agents（±s，n＝8）

與生理鹽水組相應的指標比較：＊P＜0.01，#P＜0.01vs.relevant index of normal saline group：＊P＜0.01，#P＜0.01

表2結果顯示，靜脈注射致敏后d 8，與生理鹽水組比較，喘可治注射液組豚鼠血清IL-4和總IgE水平維持在正常水平（P＞0.05），其余各組豚鼠血清IL-4和總IgE水平均升高（P＜0.01）。靜脈致敏后，豚鼠整體出現過敏反應的時間（d 8）與攻擊前豚鼠血清IL-4和總IgE水平升高時間（d 8）相平行。

3.3 藥物腹腔注射過敏反應檢查方法及IL-4和總IgE水平測定

豚鼠整體實驗情況：各組豚鼠隔日腹腔注射藥物致敏后，在d 14和d 21，以同種供試液進行攻擊，生理鹽水組和喘可治注射液組豚鼠未出現過敏反應，其余各組豚鼠均在攻擊后出現了過敏反應，馬血清組還有4只豚鼠死亡。

IL-4和總IgE水平測定結果見表3。

表3 腹腔注射致敏藥物d 14、d 21時各組豚鼠血清中IL-4及總IgE水平（±s，n＝6）Tab 3 Serum level of IL-4 and IgE of guinea pigs 14 days and 21 days after intraperitoneous administration of allergic agents（±s，n＝6）

表3 腹腔注射致敏藥物d 14、d 21時各組豚鼠血清中IL-4及總IgE水平（±s，n＝6）Tab 3 Serum level of IL-4 and IgE of guinea pigs 14 days and 21 days after intraperitoneous administration of allergic agents（±s，n＝6）

與生理鹽水組相應的指標比較：＊P＜0.01，#P＜0.01vs.relevant index of normal saline group：＊P＜0.01，#P＜0.01

表3結果表明，常規方法致敏后d 14和d 21，與生理鹽水組相比，喘可治注射液組豚鼠血清IL-4和總IgE水平維持在正常（P＞0.05），其余各組豚鼠血清IL-4和總IgE水平均升高（P＜0.01），與表1、表2的靜脈注射致敏結果一致。

4 討論

藥物引起的過敏反應以速發型過敏反應最為常見、危害也最大，現有判斷藥物引起過敏反應的方法主要有直接檢測過敏物質、被動皮膚過敏反應實驗、豚鼠回腸條實驗、豚鼠主動過敏反應檢查法等[2，3]，上述動物實驗方法存在檢驗周期偏長、過敏反應觀察指標不夠客觀等缺陷，不利于迅速得出結論。

IgE抗體在速發型過敏反應發病機制中的作用己成定論，而IL-4是輔助T細胞衍生的一類細胞因子，是促進IgE合成的最主要細胞因子，過敏原進入機體后引起IL-4和IgE升高并可保持較長時間，使機體始終處于一個高敏狀態，再次遇到同一過敏原時可導致機體產生過敏反應[4]，因而提供了一個可供快速檢測藥物引起過敏反應的新思路。

本文對近2年廣東省藥品檢驗所承擔的上述4個國家藥品評價抽驗品種進行了過敏反應的對比檢查研究。對傳統的隔日腹腔注射致敏法的給藥途徑和間隔周期進行了改進，采用連續3 d靜脈注射致敏法，證明在靜脈致敏的d 8，陽性藥物攻擊前豚鼠血清IL-4和總IgE水平明顯升高，最終結果與傳統的腹腔致敏法一樣，均可有效判斷藥物引起的過敏反應，且比傳統方法判斷過敏反應的時間提早1～2周。

本研究結果提示，血清IL-4和總IgE水平可望成為早期檢測藥物引起的過敏反應的靈敏指標，它反映了藥物靜脈注射致敏豚鼠后d 8就出現的過敏反應，避免了常規方法所存在的缺陷，符合新版《中國藥典》關于進一步加強藥物過敏反應檢查方法的研究方向，具有較好的應用價值。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，2005：附錄101.

[2]胡昌勤，許明哲，馬 越，等.含丹參的中藥注射液中過敏性雜質的檢測[J].藥學學報，2008，43（5）：518.

[3]Pullerits T.Cytokine modulation for anti-allergic treatment[J].Curr Pharm Des，2002，8（20）：1845.

[4]Bettiol J，Sele J，Henket M，et al.Cytokine production from sputum cells after allergenic challenge in IgE-mediated asthma[J].Allergy，2002，57（12）：1145.