抑肽酶對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)的影響

江承平，王曉明，吳碧華，劉 福

（川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，南充市 637007）

近年來(lái)免疫炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷中所起的作用逐漸受到關(guān)注。腦缺血再灌注過(guò)程中，在黏附分子的介導(dǎo)下，循環(huán)中的白細(xì)胞和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附、積聚、浸潤(rùn)于缺血區(qū)腦組織，釋放炎癥介質(zhì)從而加重缺血神經(jīng)元的損傷。CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞可反映機(jī)體免疫狀態(tài)的變化，抑肽酶是從牛肺中提取的一種廣譜絲氨酸蛋白酶抑制劑，具有非特異性絲氨酸蛋白酶抑制活性，在體外循環(huán)大手術(shù)出血、胰腺炎、缺血再灌注損傷等方面有多種作用。自加拿大“BART”研究發(fā)表后，由于對(duì)臨床使用的抑肽酶商品安全性存在疑問(wèn)，包括拜耳公司的特斯樂(lè)（Trasylol）在內(nèi)的抑肽酶制劑相繼暫停美國(guó)、歐洲和中國(guó)市場(chǎng)（我國(guó)于2007年暫停使用）的銷(xiāo)售，但其生理病理作用值得進(jìn)一步研究。本文擬研究大鼠腦損傷后不同時(shí)期損傷灶局部CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況的變化，探討抑肽酶在細(xì)胞免疫應(yīng)答的干預(yù)下，對(duì)腦缺血再灌注后繼發(fā)性腦損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試藥

抑肽酶（麗珠集團(tuán)麗寶生物化學(xué)制藥有限公司，批號(hào)：081023，規(guī)格：100萬(wàn)KIU·mL－1）；免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)（SP）法試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；兔抗鼠CD4+、CD8+單克隆抗體、即用型二氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器

動(dòng)物頭顱立體定位儀（西安光學(xué)醫(yī)療器械公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 動(dòng)物及分組

健康♂SD大鼠105只，體質(zhì)量280～320 g，由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（川2008-18），所有大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、模型組、抑肽酶組，每組35只。

1.4 模型制作

大鼠局灶性腦缺血再灌注模型參照Longa等[1]報(bào)道的方法，以大鼠清醒后左前肢不能完全伸展、爬行時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈為模型成功標(biāo)準(zhǔn)。假手術(shù)組除尼龍線插入深度＜15 mm外，其余過(guò)程同模型組。抑肽酶組于缺血前24 h及再灌注即刻、24 h、48 h、72 h、4 d、5 d分別尾靜脈注射5萬(wàn)KIU·100 g－1（體質(zhì)量）抑肽酶（相當(dāng)于臨床給藥劑量的10倍））；假手術(shù)組與模型組用同樣方法注射等體積生理鹽水。

1.5 標(biāo)本采集及處理

分別于術(shù)后24 h、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d 7個(gè)時(shí)間點(diǎn)，隨機(jī)抽取5只大鼠進(jìn)行灌注固定，并斷頸取腦，從視交叉吻合端至尾端冠狀連接做冰凍切片。

1.6 免疫組化檢測(cè)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況

檢測(cè)嚴(yán)格按照SP試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。每例均隨機(jī)觀察8個(gè)高倍視野，讀取陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS13.0，計(jì)量資料的均數(shù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)比較，組間均數(shù)兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察

假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)有缺血變性改變。模型組和抑肽酶組缺血梗死灶主要位于額、頂葉皮質(zhì)和紋狀體尾殼核，HE染色下表現(xiàn)為組織結(jié)構(gòu)紊亂，神經(jīng)纖維網(wǎng)呈空泡樣改變，變性、水腫明顯，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，染色淡，核固縮、溶解等，說(shuō)明大腦中動(dòng)脈閉塞法制作模型成功。

2.2 免疫組化結(jié)果

缺血再灌注損傷后各時(shí)間點(diǎn)各組CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)詳見(jiàn)表1、表2。

表1 缺血再灌注損傷后各時(shí)間點(diǎn)各組CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（±s，n＝5）Tab 1 CD4+T lymphocyte count of three groups after ischemia-reperfusion injury at different time points（±s，n＝5）

表1 缺血再灌注損傷后各時(shí)間點(diǎn)各組CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（±s，n＝5）Tab 1 CD4+T lymphocyte count of three groups after ischemia-reperfusion injury at different time points（±s，n＝5）

與假手術(shù)組比較：#P＜0.05；與模型組比較：＊P＜0.05vs.sham operation group：#P＜0.05；vs.model group：＊P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組抑肽酶組時(shí)間24 h 21.11±11.0267.34±20.43#44.09±16.22＊4 d 20.16±9.3682.61±13.14#57.69±10.43＊6 d 19.98±12.2090.15±7.86#70.00±12.62＊8 d 20.19±11.19120.11±10.32#103.11±10.27＊10 d 19.92±9.08143.52±12.03#97.33±10.11＊12 d 21.02±10.00131.22±7.45#95.33±9.03＊14 d 20.09±10.08111.89±12.52#80.43±10.40＊

表2 缺血再灌注損傷后各時(shí)間點(diǎn)各組CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（±s，n＝5）Tab 2 CD8+T lymphocyte count of three groups after ischemia-reperfusion injury at different time points（±s，n＝5）

表2 缺血再灌注損傷后各時(shí)間點(diǎn)各組CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（±s，n＝5）Tab 2 CD8+T lymphocyte count of three groups after ischemia-reperfusion injury at different time points（±s，n＝5）

與假手術(shù)組比較：#P＜0.05；與模型組比較：＊P＜0.05vs.sham operation group：#P＜0.05；vs.model group：＊P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組抑肽酶組時(shí)間14 d 15.41±8.02100.54±3.73#75.69±5.41＊24 h 15.36±7.6843.72±8.31#30.00±5.33＊4 d 16.42±8.5256.15±5.04#42.07±8.90＊6 d 15.88±8.5275.31±6.80#59.78±8.54＊8 d 14.98±7.8995.44±7.00#98.31±6.81＊10 d 15.78±7.56120.38±4.50#88.31±3.12＊12 d 16.02±6.89113.67±3.89#81.00±8.93＊

由表1、表2可見(jiàn)，模型組大鼠缺血再灌注損傷后24 h損傷灶局部CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)即有明顯升高，且逐漸上升，至傷后10 d達(dá)最大值。抑肽酶組大鼠缺血再灌注損傷后24 h損傷灶局部CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)也有升高，但低于模型組（P＜0.05），且傷后8 d達(dá)高峰，其余各時(shí)間點(diǎn)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均低于模型組（P＜0.05）。假手術(shù)組CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)則無(wú)明顯增加。

3 討論

腦缺血一定時(shí)間恢復(fù)血液供應(yīng)后，會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的腦機(jī)能障礙，稱(chēng)之為腦缺血再灌注損傷，其與自由基的生成、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸毒性、白細(xì)胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等有關(guān)。不同類(lèi)型的腦組織損傷中，免疫反應(yīng)參與繼發(fā)性損傷的發(fā)病過(guò)程[2]，且多數(shù)研究[3，4]認(rèn)為免疫反應(yīng)加重了繼發(fā)性腦損傷。另有研究[5]表明顱腦損傷后不同時(shí)期血液中髓鞘堿性蛋白抗體效價(jià)與腦橋脫髓鞘病變的程度之間呈密切的正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明體液免疫應(yīng)答可能參與繼發(fā)性腦損傷的病理過(guò)程[5]。李衛(wèi)等[6]發(fā)現(xiàn)，患者腦脊液中的IgG含量與早期的Lasgow評(píng)分及恢復(fù)期的殘疾評(píng)分密切相關(guān)，亦提示體液免疫反應(yīng)加重繼發(fā)性腦損傷。CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞與神經(jīng)元凋亡呈密切的相關(guān)性[7]，通過(guò)介導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡加重腦組織繼發(fā)性損傷，且與顱腦損傷后期腦萎縮密切相關(guān)。

抑肽酶是一種非特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑，以往被廣泛應(yīng)用于臨床以減少心臟手術(shù)圍手術(shù)期的出血，對(duì)凝血、纖溶以及炎癥的發(fā)展變化都有一定影響。目前發(fā)現(xiàn)抑酶肽可抑制激肽釋放酶及補(bǔ)體系統(tǒng)而抑制組織損傷所致的炎癥反應(yīng)；抑制一氧化氮（NO）合成酶等從而抑制自由基的產(chǎn)生，保護(hù)組織器官免受自由基所致的過(guò)氧化反應(yīng)，從而發(fā)揮器官保護(hù)作用。盡管抑肽酶可抑制中性粒細(xì)胞的活化而降低全身炎性反應(yīng)發(fā)生的程度，但其抗炎反應(yīng)的確切機(jī)制尚不明確。過(guò)去的臨床或體外實(shí)驗(yàn)研究[8]表明，使用抑肽酶抑制中性粒細(xì)胞的活化（如細(xì)胞表面蛋白表達(dá)，彈性蛋白酶，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）的釋放）。Hill等[9]認(rèn)為，抑肽酶能促進(jìn)急診體外循環(huán)（Emergency extracorporeal circulation，ECC）后IL-10的釋放；Miller等[10]認(rèn)為大劑量的抑肽酶能夠在下調(diào)促炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8分泌的同時(shí)，上調(diào)抗炎因子IL-10的分泌，以此來(lái)平衡機(jī)體的免疫功能。

本研究應(yīng)用血管內(nèi)線栓法造成大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞制作局灶性腦缺血再灌注模型。HE染色結(jié)果顯示造模成功。免疫組化結(jié)果顯示，傷后24 h腦組織損傷灶局部CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)即有明顯增加，且逐漸同步上升，至傷后10 d達(dá)到最大值，此后逐漸下降。抑肽酶組各時(shí)間點(diǎn)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量均低于模型組，而增加趨勢(shì)與模型組相同。由此可以推論出抑肽酶可能通過(guò)抑制CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，減少神經(jīng)元的凋亡，從而減輕腦缺血再灌注損傷。

總之，腦缺血再灌注損傷是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，有多種因素參與。本實(shí)驗(yàn)從免疫炎癥反應(yīng)的角度探討了抑肽酶對(duì)腦缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用，但抑肽酶與CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞之間的關(guān)系，在腦缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)如何變化有待更深入的研究。

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