咬合創傷誘導海馬區星形膠質細胞的上調

賈 靜 劉洪臣 劉雪梅 章捍東

海馬是神經系統的高級核團，邊緣系統的重要組成部分，普遍的觀點認為海馬的功能與記憶、情緒等反應有關[1,2]，而對于海馬的其它功能卻知之甚少。近年來的一些研究顯示海馬可能在疼痛的調節中起作用。以往對咬合創傷的研究顯示，咬合創傷后能引起初級感覺中樞內SP、NMDAR、PPTA以及膠質細胞的改變[3-5]，但對于海馬的結構和功能影響卻未見報道。本實驗通過建立咬合創傷動物模型，觀察大鼠咬合創傷后海馬區星形膠質細胞的變化，了解海馬結構是否參與了咬合創傷的反應及調節。

1.材料和方法

1.1 實驗動物 選用健康雄性SD大鼠35只，體重280-320g，鼠齡10-12w。將其平均分為7組，一組作為對照，其余六組分別為咬合創傷1d、3d、7d、2w、4w、5w組。所有大鼠自由飲水，喂食硬質鼠料，于動物房適應性飼養一周后進行實驗。

1.2 咬合創傷動物模型的建立 10%水合氯醛麻醉大鼠，于左側上頜第一磨牙面粘結方絲，抬高咬合0.5mm,形成左側磨牙早接觸的創傷咬合，待粘結劑徹底干燥后，將動物放回正常飼養。各組動物到達預定時間點后，以100g/L水合氯醛腹腔深度麻醉后開胸，經升主動脈插管，先以生理鹽水100ml沖洗血液，繼以含40g/L多聚甲醛的0.1mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)500ml灌流2h，注畢立即取全腦置于200g/L蔗糖溶液(4℃)浸泡，直至完全沉底。連續冰凍冠狀切片，片厚10μm，置于0.01mol/L的PBS中。

1.3 免疫熒光染色 切片在0.1mol/L PBS中漂洗后，入含0.5%Triton X-100的0.1mol/L PBS中浸泡30min(室溫)，然后入兔抗GFAP抗體稀釋液(1∶100)，4℃冰箱過夜后，0.1mol/L PBS振洗30分鐘，入TRITC-IgG室溫孵育2小時，0.1mol/L PBS振洗后Moviol封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察，采集圖像。

1.4 圖像采集及分析 激光共聚焦顯微鏡下采集免疫熒光染色圖像，每張切片選取5個視野，計數膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)陽性星形膠質細胞數。對各實驗組與對照組的比較采用方差分析，統計過程采用Stata7.0軟件進行。

2.結果

正常大鼠海馬區平均GFAP陽性星形膠質細胞數為42.2±6.54，7d組GFAP陽性細胞數量開始增加，2w組GFAP陽性細胞數繼續上升，4w組達高峰，主要分布在CA1區及CA3區，但以CA3區為主，5w時陽性細胞數開始下降，與2w組陽性率接近(圖1-3,附表)。

附表 咬合創傷后大鼠海馬CA3區GFAP陽性細胞數(個/mm2)

3.討論

海馬是邊緣系統中的重要結構，與其它腦區有著廣泛的纖維聯系。是調節學習、記憶、行為、情緒反應的重要神經解剖學基礎。同時在應激調控中也起著非常重要的作用。近年來的研究顯示，海馬可能參與痛感覺反應和痛調控。給予致痛強度熱刺激，可引起海馬局部血流發生改變；在海馬齒狀回局部注射利多卡因，可以減輕由熱刺激引起的疼痛，而注射IL-2或刺激海馬背部可提高痛閾[6]。提示海馬參與了傷害性刺激的過程。

海馬在痛覺調控中的作用研究較少，集中在海馬神經元對疼痛刺激的反應上。動物模型顯示，來自不同區域的傷害性刺激可引起海馬不同區域的不同變化。Khanna等發現足底注射福爾馬林可以誘導海馬CA1區c-fos的表達增加[7,8]。同時海馬CA3、CA4區PKC免疫陽性細胞增多。而電刺激大鼠牙髓卻引起海馬CA1區c-fos的表達減少[9]。

膠質細胞在疼痛產生及維持中也發揮了重大作用。在病理性痛刺激作用下,激活的膠質細胞可釋放多種神經活性物質,如花生四烯酸、白細胞三烯、前列腺素、一氧化氮、興奮性氨基酸、神經生長因子等[10]，這些活性物質直接調控著神經元的活動，它們作用于痛覺傳遞神經元使其處于敏化狀態，而活化的膠質細胞可以進一步加強初級傳入纖維終末釋放SP、EAA和增加產生疼痛物質神經元的興奮性來調節疼痛[11]，同時通過調控神經活性物質的攝取間接影響神經元的生物活性[12]。本課題組以往的研究顯示咬合創傷引起了三叉神經脊束核初級感覺中樞內星形膠質細胞及細胞因子的RNA表達變化[5]，咬合創傷后三叉神經脊束核尾側亞核內GFAP、IL-1、TNFαmRNA表達上調，且三者呈現一致性相關變化規律，但對于神經系統的高級核團海馬是否參與了咬合創傷的口頜面痛反應卻未見報道。星形膠質細胞中的膠質原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acid protein,GFAP)，是星形膠質細胞的標志蛋白，可利用GFAP的特異性抗體檢測星形膠質細胞。

本實驗通過對海馬區 GFAP陽性星形膠質細胞免疫染色發現，創傷后7d，海馬內GFAP陽性細胞數開始增加，2w組GFAP陽性細胞數繼續上升，4w時達到高峰。主要分布在CA1區及CA3區，但以CA3區為主，5w時GFAP陽性細胞數開始下降。但仍保持較高水平。通過實驗我們觀察到，咬合創傷的刺激引起了海馬CA1、CA3區星形膠質細胞的數量增加，提示海馬結構參與了咬合創傷反應，推測海馬的CA1、CA3區與咬合創傷所致口頜面痛及痛情緒調控關系密切，尤其CA3區，是口面部傷害性刺激的主要投射區。

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