獨活對癡呆大鼠腦中 p38MAPK信號轉導通路的影響

張 杰 杜文彬

(遼寧中醫藥大學附屬醫院,遼寧 沈陽 110032)

阿爾茨海默病(AD)是發生在早老及老年期、不可逆轉的、漸進性的、以精神行為異常為主的腦變性疾病,晚期可危及患者的生命,其發病率和死亡率逐年上升。AD的病理機制尚未明確。近年發現非甾類抗炎藥對本病具有一定的治療作用,進而使本病的免疫炎癥假說得到關注。本病在中醫屬癡呆的一種,中醫多認為以五臟虛損為本,濕痰瘀為標,研究以祛風勝濕藥獨活為本病治療的切入點,采用非甾體抗炎藥為對照,探討獨活在抑制 AD免疫炎性損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 β-淀粉樣蛋白(1～40)的制備 Aβ1～40,瑞士巴亨公司,批號為 0710120,實驗前 1 w以無菌生理鹽水將 Aβ1-40稀釋成2 g/L溶液,37℃溫箱孵育 1w,使其變為凝聚態的 Aβ1～40。

1.2 模型復制 Wistar3.5月齡的雄性成年大鼠 30只,購于中國醫科大學實驗動物中心(合格證書 SCXK遼 2003-0009號),體重為(350±21)g。大鼠經腹腔注射 10%的水合氯醛(4 ml/kg體重)腹腔麻醉動物。大鼠麻醉成功后,將其固定于江灣 I型 C大鼠立體定位儀上,常規備皮消毒,切開皮膚,暴露前囟,參照包新民的《大鼠腦立體定位圖》,在左右側海馬區(前囟后 3.0 cm,中線左右側 2.0cm)用微型鉆鉆開顱骨,切開硬腦膜,用微量注射器自腦表面垂直進針 2.5 cm,緩慢注入凝聚態 Aβ1～401μl,留針 5 min,以使 Aβ充分彌散,然后緩慢撤針,縫合切口。假手術組注以等量生理鹽水。術后 7 d,進行水迷宮測試。

1.3 動物分組與給藥 手術前麻醉死亡 2只,1只手術過程中死亡(假手術組),均考慮麻醉死亡。將手術后 30只隨機分為 4組,丹參組、獨活組、西藥組、模型組,每組 6只。假手術組注射生理鹽水。依據等效劑量換算直接計算法,將成人臨床用量換算為大鼠等效劑量,將上述藥物配成獨活組及丹參組每日分別以獨活丹參以上述濃度灌胃,2 ml?只-1?d-1,西藥組每日以吲哚美辛以上述濃度灌胃,2 ml?只-1?d-1,假手術組每日以生理鹽水灌胃,2 ml?只-1?d-1,共 4 s。實驗至第 28天始,進行藥后空間學習記憶能力訓練測試 3 d。

1.4 標本制備及p38 MAPK檢測 取血后,除去大鼠顱蓋,取出完整大腦組織,剝離海馬組織。采用 Western印跡法檢測海馬組 p38 MAPK,采用 Flourchem V 2.0凝膠成像分析軟件(A-merica)分析。

1.5 統計學方法 數據以x±s表示,組間比較,采用配對 t檢驗和單因素方差分析。

2 結 果

2.1 獨活對大鼠逃避潛伏期的影響 各組大鼠手術前逃避潛伏期無顯著差異(P＞0.05);各組給藥前(除假手術組)與手術前比較差異顯著性(P＜0.05)。給藥后除模型組、假手術組外,各組與給藥前比較,逃避潛伏期均有縮短(P＜0.05),見表 1。

表1 大鼠手術前后逃避潛伏期(x±s,s)

2.2 獨活對癡呆大鼠p38MAPK的影響 不同組別的大鼠海馬組織內 p38 MAPK的表達有明顯差異(P＜0.05),p38 MAPK的表達在模型組明顯升高(0.944±0.110),而假手術組的表達在較低水平(0.454±0.081),獨活組及西藥組的 p38 MAPK表達較模型組有所降低(0.512±0.039,0.528±0.013),差異顯著(P＜0.05),獨活組、西藥組 p38 MAPK表達水平較丹參組降低(0.808±0.020),但差別不顯著(P＞0.05)。丹參組與模型組比較,p38 MAPK表達有所降低,但差別不顯著(P＞0.05),見圖 1。

圖1 各組大鼠 p38MAPK表達

3 討 論

促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)鏈是真核生物信號傳遞網絡中的重要途徑之一,在基因表達調控和細胞質功能活動中發揮關鍵作用。p38 MAPK是 MAPK家族的主要成員之一,參與了炎癥、應激、細胞周期調控等病理生理過程〔1,2〕,其信號轉導通路在炎癥與細胞凋亡等應激反應中發揮重要作用。p38 MAPK被磷酸化激活后,可以進一步激活其下游的激酶或多種轉錄因子,如蛋白激酶 MAPK APK 2、轉錄因子 ATF2、Erk 1等〔3〕,產生一系列細胞內效應,從而誘導一些特定基因的表達,包括誘導型一氧化氮合酶、選擇素、腫瘤壞死因子 α(TNFα)、白細胞介素(IL)-1β等。活化的p 38 MAPK進入細胞核內使核轉錄因子磷酸化,從而調節基因轉錄,產生細胞因子,引起細胞增殖、分化、凋亡及細胞因子的合成,誘導 p38-caspase-3促凋亡通路。這些基因表達產物在腦神經細胞凋亡、炎性反應等過程中發揮著重要作用。另一方面,p38在 AD中主要以 2種途徑發揮炎癥相關作用:①作為炎性細胞因子的上游調控者,在細胞面對應激時活化,參與傳導促炎信號,通過轉錄激活增加促炎細胞因子的合成,間接引發一系列病理效應;②p38還可作為炎性細胞因子的下游信號中繼,介導促炎細胞因子的作用乃至炎癥引發的有害效應,直接破壞 AD神經元。總之,p 38MAPK在AD病程中可能處于一個類似炎癥過程的正反饋環內,只是由它介導產生效應的該種物質已不僅僅是炎癥,而是 AD中神經元和非神經元的各類破壞和損傷〔4〕。

鑒于 p38 MAPK信號轉導通路在Aβ引起的毒性反應中起著重要作用,探討獨活對調節MAPK信號轉導通路的作用可能部分揭示獨活在 AD治療中的作用。本研究提示,獨活可抑制Aβ大鼠腦中p38 MAPK的激活,一方面可抑制其對促炎信號的轉導作用,也可以抑制其作為炎性細胞因子的下游信號中繼而介導的炎癥引發的有害效應,減輕小膠質細胞的引起的炎性反應;另一方面,可阻斷 p38-caspase-3促凋亡通路,減少神經元細胞的凋亡。丹參組 p38 MAPK較模型組有所減低,但無統計學意義,提示活血化瘀方藥丹參在抑制p 38 MAPK通路方面作用較弱,可能通過其他途徑抑制細胞凋亡的發生,西藥組 p38 MAPK較獨活組有所下降,提示非甾類抗炎藥物可能在抑制p 38 MAPK的活性方面要優于獨活。

綜上所述,當聚集的Aβ蛋白刺激小膠質細胞增生,產生一系列細胞毒性效應后,機體產生內源性炎癥因子形成“級聯效應”,可引起廣泛的神經細胞損害。由于炎癥因子及代謝產物數量眾多,僅針對其中某一種或幾種進行干預,往往達不到預期目的,因此通過阻斷封閉炎癥因子(如給予 IL-1Ra,TNF-R等)效果可能不十分理想。研究發現盡管炎癥因子數量眾多,但進入細胞內的信息通道卻為數較少,如能對其中關鍵的信號通路進行有效阻斷和調節,這對于調控炎癥因子及應激蛋白的表達,具有目標明確,效果明顯的優勢。p38 MAPK通路是參與炎癥反應調控的重要信號系統〔5〕。中藥獨活可抑制 p38 MAPK的活性,在信號通路水平阻斷和調控 p38 MAPK的表達和活性,從而抑制AD腦中的慢性炎癥反應,為中藥防治阿爾茨海默病提供了一條新的治療思路。

1 Irving EA,Barone FC,Reith AD,et al.Differential activation of MAPK/ERK and p38/MAPK in neurons and glia following focal cerebral ischemia in the rat〔J〕.Mol Brain Res,2004;77(1):65-75.

2 Legos JJ,Erhardt JA,White RF,et al.SB239063,a novel p38 inhibitor,attenuates early neuronal injury following ischemia〔J〕.Brain Res,2003;892(1):70-7.

3 Takagi Y,Nozaki K,Sugino T,et al.Phosphorylation of cJun NH2terminal kinase and p38 mitogen-activated protein kinase after transient forebrain is chemia in mice〔J〕.Neurosci Lett,2000;294(2):117-20.

4 劉海霞,何 建.p38MAPK的轉導機制及相關疾病〔J〕.中國急救醫學,2003;23(12):883.

5 Bu XN,Huang P,Qi ZF,et al.Call type-specific actiuation mice〔J〕.Neurochem Int,2007;51(4):459-66.