纈沙坦對擴張型心肌病心衰大鼠心肌細胞凋亡相關蛋白的影響

張贏予 張馨木 蘇兆亮 李衛東 尹春陽 陳建華 張國輝

(江蘇大學附屬人民醫院,江蘇 鎮江 212002)

美國國立衛生院(NIH)制訂的心血管疾病戰略,鼓勵從凋亡等方面,將心力衰竭和擴張型心肌病(DCM)的分子細胞機制聯合研究〔1〕。血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensin II type 1 receptor,AT1R)拮抗劑纈沙坦(Valsartan,Val)對于治療老年心力衰竭、自發性高血壓能夠有效抑制心肌細胞凋亡〔2～6〕,在心肌缺血再灌注損傷中也能減輕心肌細胞凋亡,減輕缺血再灌注損傷,保護心臟〔7〕。而 Val對于 DCM心肌細胞凋亡的影響及其相關機制尚未見系統研究。本研究通過觀察 Val對DCM心衰大鼠心肌細胞凋亡的影響,探討 Val降壓外的心臟保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠,8周齡,體重 220～260 g,由江蘇大學實驗動物中心提供〔許可證號:SYXK(蘇)2008-0024〕。

1.2 實驗儀器及試劑 X-22R型冷凍離心機(美國 Beckman公司),勻漿機(德國 IKA公司),冰凍切片機、熒光倒置顯微鏡(德國 Leica公司),垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司)。阿霉素(浙江海正藥業有限公司,批號:070301),Val(北京諾華制藥有限公司,批號:080401),氯胺酮(江蘇恒瑞醫藥有限公司,批號:HK071105)。試劑:考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程有限公司,批號 20090511),甘露醇、蔗糖、琥珀酸(Sigma公司),Hepes(Amresco公司),EDTA(上海五聯化工廠),Tris(上海潤捷化學試劑有限公司)。

1.3 動物分組及處理 將 40只 SD大鼠完全隨機分為模型組(DCM組,n=15),Val干預組(DCM+Val組,n=15)和對照組(C組,n=10)。DCM組及 DCM+Val組給予阿霉素(2 mg/kg,1次/w)腹腔注射,C組給予相同體積生理鹽水腹腔注射。DCM+Val組每日給予Val(30 mg/kg)灌胃給藥,DCM組及 C組給予同體積生理鹽水灌胃,持續給藥 8 w。于第 8周實驗結束時麻醉大鼠,采血后迅速取出心臟,一部分 4%中性甲醛固定,另一部分用生理鹽水制成 10%組織勻漿,測定相關指標。

1.4 Western印跡檢測 VDAC、Smac蛋白的表達 采用 Western印跡檢測電壓依賴陰離子通道(voltage-dependent anion channels,VDAC)、第二個線粒體來源的胱氨酸酶激活劑(second mitochondria-derived activator of caspase,Smac)蛋白表達情況。步驟如下:提取各組大鼠心肌組織總蛋白,Bradford法進行蛋白定量后進行 SDS-PAGE,電泳結束后將蛋白轉印至 PVDF膜,用含 5%脫脂奶粉的TBST 4℃封閉過夜,TBST洗滌。一抗孵育過夜,洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的二抗,室溫孵育1 h,洗滌后用ECL plus顯色,Typon多功能激光掃描成像系統掃描,用凝膠圖像處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值,相對灰度值的計算為各蛋白與內參 β-actin的比值,表示蛋白的相對表達水平。

1.5 免疫組化染色法檢測VDAC、Smac蛋白的表達 各組大鼠心肌組織固定 24 h,常規石蠟包埋、切片,厚度約 4～5μm,貼附于涂有多聚賴氨酸的載玻片上,采用免疫組化SP法檢測VDAC、Smac蛋白的表達。判定標準:陽性細胞胞漿呈棕褐色,著深棕色者為強陽性表達細胞,不著色者為陰性表達細胞,介于兩者之間者為弱陽性表達細胞。

1.6 心肌細胞凋亡指數(cardiac myocyte apoptosis index,CMAI)的檢測 采用 Td T介導的 d UTP缺口末端標記技術(TUNEL)檢測各組石蠟切片 CMAI,參照文獻方法〔8〕,按照試劑盒說明書操作。200倍光鏡下觀察結果,每張切片隨機選擇5個高倍鏡視野,計數視野中凋亡陽性染色的心肌細胞數及心肌細胞總數的比例即 CMAI。判斷標準:核藍染者為陰性細胞,即未發生凋亡的正常心肌細胞;胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞,即凋亡細胞。按公式計算:CMAI=陽性細胞數/心肌細胞總數 ×100%。

1.7 統計學方法 所有數據用 SPSS16.0統計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA),計量資料數據以 x±s表示,多組間均數比較采用 Student-Newman-Keuls法。

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌組織 VDAC、Smac蛋白表達的 Western印跡結果比較 DCM組和DCM+Val組大鼠心肌組織中 VDAC、Smac蛋白相對表達水平顯著高于 C組(均 P＜0.05);但與DCM組相比,DCM+Val組大鼠心肌組織中兩種蛋白的表達水平顯著下降(P＜0.05)。見圖 1。

圖1 各組大鼠心肌組織 VDAC、Smac蛋白的表達

2.2 各組大鼠心肌組織VDAC、Smac蛋白表達的免疫組化結果比較 C組大鼠心肌組織中,大部分為胞漿藍染的陰性細胞,僅見少量的 VDAC、Smac陽性細胞;DCM組和 DCM+Val組大鼠心肌組織中 VDAC、Smac陽性細胞數顯著高于 C組,胞漿中可見大量的棕黃色顆粒;與 DCM組相比,DCM+Val組大鼠心肌組織中兩種蛋白陽性的細胞數顯著減少。見圖 2。

圖2 各組大鼠心肌組織 VDAC、Smac蛋白表達的免疫組化結果(×200)

2.3 各組大鼠心肌 CMAI的比較 與 C組相比,DCM組和DCM+Val組大鼠 CMAI顯著升高(P＜0.05);與 DCM組相比,DCM+Val組大鼠CMAI有所降低,但差別無統計學意義(P＞0.05)。 見圖 3,圖 4。

圖3 各組大鼠心肌組織 TUNEL結果(×200)

圖4 各組大鼠心肌CMAI的比較

3 討 論

心肌細胞凋亡廣泛存在于心力衰竭、心肌梗死、心肌缺血再灌注和冠狀動脈微栓塞中,是導致心血管疾病的重要原因〔9〕。細胞凋亡的兩條經典通路為死亡受體通路(外源性通路)和線粒體通路(內源性通路),其中線粒體凋亡通路在細胞凋亡中發揮重要的作用。心肌組織是高耗能組織,線粒體的含量極其豐富,因此,線粒體凋亡通路在心肌凋亡中扮演著重要的角色。

VDAC是存在于線粒體外膜上含量最豐富的膜蛋白,是細胞色素酶 C釋放通道外膜的組成成分,也是促凋亡和抗凋亡蛋白的瞄定點,具有單通道傳導性、選擇性、電壓依賴性。其閉合可以抑制線粒體功能,導致線粒體膜通透性的改變,使得細胞色素 C、Smac/Diablo、細胞凋亡因子等釋放,最終導致凋亡。VDAC受多種因素的影響,如缺氧、細胞低氧、乙醇、活性氧和活性氮、細胞因子、激酶、NADH的增加可以抑制 VDAC,促進呼吸鏈底物如短鏈脂肪酸和乙醛氧化〔10～15〕。促凋亡線粒體蛋白Smac是細胞凋亡線粒體信號通路中的重要調節分子之一。在心肌組織中含量豐富,但是否參與了阿霉素損傷導致的心肌細胞凋亡,目前尚未見報道。大量研究表明,Smac在凋亡發生過程中起著關鍵作用。正常情況下,Smac位于線粒體膜間隙。在細胞受到各種凋亡誘導因素刺激時,其線粒體定位信號肽被切除,形成有活性的蛋白,由線粒體釋放入胞質,特異結合凋亡抑制蛋白(IAPs),并解除其對 caspases等的活性抑制作用,從而使 caspase-3、caspase-9活性增強,促進細胞凋亡發生〔16,17〕。本實驗 Western印跡和免疫組化研究結果顯示,DCM組大鼠心肌組織中 VDAC、Smac蛋白表達較 C組顯著升高,說明這兩種蛋白參與了阿霉素誘導的擴張型心肌病心衰大鼠的心肌凋亡過程,而DCM+Val組大鼠心肌組織中兩種蛋白的表達較DCM組顯著下降,可能的機制為 Val通過 AT1受體的作用,部分阻斷了心衰發生發展過程中 AngⅡ引起的心肌細胞凋亡。本實驗測觀測到 Smac參與阿霉素心肌損傷后的病理生理改變,推測在損傷過程中 Smac可能是通過線粒體凋亡途徑來介導心肌凋亡的。本實驗結果顯示,DCM+Val組大鼠CMAI較 DCM組有所降低,但無統計學意義,其原因可能為在 DCM心肌細胞凋亡的晚期階段,心肌細胞已經發生了不可逆的變化,Val的干預只能部分減緩凋亡發生的進程,而不足以阻止凋亡的發生。

綜上所述,DCM發生發展過程中,線粒體蛋白參與了心肌細胞的過度凋亡,進而引起心肌組織的損傷。外源性給予 Val可以通過某些途徑抑制線粒體參與凋亡的蛋白的改變,進而起到保護心臟的作用,但其具體作用機制尚需進一步研究確定。而且,在DCM心衰發展的病理生理過程中,線粒體凋亡通路中是否還存在其他影響因素,尚需進一步研究。

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