Id3基因在心肌營養(yǎng)素 1促心肌成纖維細胞增殖中的作用

周瑞紅 李菊香 夏子榮 顏素娟 譚秋波

(蘇州市木瀆人民醫(yī)院,江蘇 蘇州 215100)

近年有研究發(fā)現(xiàn)心肌營養(yǎng)素-1(CT-1)與高血壓心室重塑有一定的關(guān)聯(lián),在 12周齡的自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)的肥厚心室肌中,CT-1 mRNA明顯升高〔1〕。另有研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性或外源性的 CT-1能刺激成纖維細胞合成DNA及膠原,促進成纖維細胞生長〔2〕。分化抑制因子(Id)3作為血清誘導的立即早期基因在小鼠成纖維細胞系中被首次發(fā)現(xiàn),其基因由 3個外顯子和 2個內(nèi)含子組成〔3〕。Id3參與多種細胞生物學過程,包括骨骼肌的分化、血管平滑肌的增殖、胚胎的神經(jīng)形成、骨和血管發(fā)生等〔4～7〕,表明 CT-1與 Id3均存在于成纖維細胞中,且都有促進細胞增殖的作用,但他們之間是否存在某種聯(lián)系,Id3在心肌成纖維細胞中的表達情況及 CT-1促心肌成纖維細胞增殖的作用是否與 Id3有關(guān)尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料 出生 1～3 d的SD乳鼠(南昌大學醫(yī)學院醫(yī)學實驗動物科);RT-PCR試劑(Promega,USA);Trizol(Invitrogen,USA);DEPC,二甲基亞砜(DMSO)(Ameresco,USA);DL2000 DNA Ladder Marker(上海生工);MTT增殖檢測試劑盒(Sigma,USA)。

1.2 方法

1.2.1 心肌成纖維細胞的原代培養(yǎng)及鑒定 在無菌條件下摘取 4～5只大鼠心臟,分離心室利用蛋白酶消化心肌組織,差速貼壁法獲得原代心肌成纖維細胞。第 3～4代細胞用于實驗。鑒定方法參照文獻〔9〕。

1.2.2 CT-1反義鏈與正義鏈的設計與合成 以硫代磷酸修飾反義和正義寡核苷酸鏈,由上海生物工程有限公司合成,各自序列為:CT-1反義寡核苷酸鏈(ASODN):5′-TGGCTCATGCTGGCCCCAGGCTGAT-3;CT-1正義寡核苷酸鏈(ASODN):5′-ATCAGCCTG′GGGCCAGCATGAGCCA-3′。

1.2.3 實驗分組及干預措施 ①空白對照組(C):大氣壓下培養(yǎng);②高靜水壓組(P):160 mmHg壓力下培養(yǎng) 8 h〔9〕;③CT-1反義寡核苷酸組(ASODN組):160 mmHg壓力培養(yǎng)下,加入終濃度為 10μmol/L的 ASODN;④CT-1正義寡核苷酸組(SODN):160mmHg壓力培養(yǎng)下8 h,加入終濃度為 10μmol/L的SODN。

1.2.4 RT-PCR法檢測 Id3 mRNA的表達 按照Trizol試劑說明書提取心肌細胞總 RNA。參照 Promege公司提供的 RT-PC試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應,PCR反應共 35個循環(huán)。引物設計由 Gen Bank中獲取目的基因全序列,借助 primer primier 5.0軟件設計完成,由上海生工合成,各引物序列(含參照序列①和目的序列②)見下 :①β-actin正義 5′-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′;反義 5′-ACTCATCGTACTCCTGCTTG-3′,240 bp。②Id3 正義 5′-CATCTCCCGATCCAGACA-3′;反義 5′-TCATAATCAGGGCAACAGAG-3′;494 bp。

1.2.5 蛋白表達的檢測 Western印跡法檢測細胞裂解液中CT-1蛋白表達情況,用 Lab Work 3.0 UVP軟件分析條帶的積分吸光度值,相對蛋白含量用積分吸光度值表示。

1.2.6 心肌成纖維細胞增殖檢測(MTT法) 在各種條件培養(yǎng)下的 96孔板實驗結(jié)束前 4 h,每孔加入 5g/L的 MTT(四氮唑鹽)20μl,實驗結(jié)束后,棄去各孔中的培養(yǎng)基,每孔加入DMSD 150μl,振蕩 10min,酶標儀測 490 nm吸光度。

1.3 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)以x±s表示,應用 SPSS12.0軟件。組間比較采用獨立樣本 t檢驗,多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析(ANOVA),兩組均數(shù)間比較采用 LSD檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 高靜水壓對心肌成纖維細胞Id3 mRNA表達的影響 在160mmHg高靜水壓下,Id3 mRNA表達明顯增加(P＜0.05);ASODN組 Id 3mRNA的表達明顯低于 P組和 C組(P＜0.05);SODN組與 P組相比無顯著差異(P＞0.05)。見圖 1,表 1。

2.2 高靜水壓對心肌成纖維細胞 CT-1蛋白表達的影響 在160mmHg高靜水壓下,CT-1蛋白表達明顯增加(P＜0.01);ASODN組 CT-1蛋白表達明顯低于 P組(P＜0.01);SODN組與P組相比無顯著差異(P＞0.05)。見表 1,圖 2。

圖1 各組Id3 mRNA表達電泳圖

表1 各組 Id 3 mRNA、CT-1蛋白表達灰度值及心肌成纖維細胞增殖(mTT法)比較(x±s,n=6)

圖2 各組 CT-1蛋白表達

2.3 MTT檢測CT-1的ASODN對高靜水壓刺激成纖維細胞的影響 成纖維細胞經(jīng) 160 mmHg的壓力作用 8 h后,明顯增殖(P＜0.05),CT-1ASODN能抑制高靜水壓所致的細胞增殖(P＜0.05),而 CT-1SODN組對高靜水壓的促細胞增殖作用無影響,表 1。

3 討 論

CT-1主要存在于心臟組織中,是心臟正常生長、發(fā)育所必需的物質(zhì)。心肌細胞和成纖維細胞都能表達 CT-1,且心肌中CT-l mRNA濃度和蛋白水平在 Dahl鹽敏感大鼠的左室肥厚階段和充血性心力衰竭階段均明顯增高。另有研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性或外源性的 CT-1能刺激成纖維細胞合成DNA及膠原,促成纖維細胞生長。因此 CT-1在心室重塑(包括心肌成纖維細胞增值、心肌細胞肥大、膠原沉積等)中發(fā)揮重要作用,而其作用途徑尚有待進一步研究。Id又稱DNA結(jié)合抑制因子(inhibitor of differentiation/DNA binding),包括 Id1～Id 4,屬于螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,主要通過與 A類堿性 HLH(bHLH)蛋白(如E蛋白)結(jié)合而發(fā)揮作用;因其本身缺乏 DNA結(jié)合必需的堿性氨基酸序列,Id蛋白和E蛋白結(jié)合形成異二聚體后能夠阻止 E蛋白和其他 bHLH蛋白結(jié)合,對 bHLH轉(zhuǎn)錄因子活性起負調(diào)節(jié)作用〔8～10〕。Id 3作為血清誘導的立即早期基因在小鼠成纖維細胞系中被首次發(fā)現(xiàn),其表達受多條信號轉(zhuǎn)導途徑的調(diào)控,誘導Id3表達的因素有:血小板衍生生長因子、甲狀腺刺激素、表皮生長因子、肝細胞生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子、腫瘤壞死因子等,不同的刺激因素作用于不同的組織細胞,通過不同的信號途徑,可導致 Id3表達水平不同程度的升高或降低,其表達呈細胞特異性和雙向調(diào)節(jié)性。因此 Id 3參與多種細胞生物學過程,包括骨骼肌的分化、血管平滑肌和腫瘤細胞的增殖、胚胎的神經(jīng)形成、骨和血管發(fā)生等〔4～7〕。

筆者以往的研究發(fā)現(xiàn)心肌成纖維細胞在 160 mmHg高靜水壓下培養(yǎng) 8 h后,與對照組相比心肌成纖維細胞達到最大增殖效果〔11〕,本研究發(fā)現(xiàn)在此條件下 CT-1的表達亦明顯增加,同時發(fā)現(xiàn) Id 3mRNA在心肌成纖維細胞中也有明顯表達;當使用CT-1ASODN干預后,心肌成纖維細胞增殖明顯減弱,CT-1的表達明顯減少,Id3 mRNA在心肌成纖維細胞中的表達也明顯下調(diào),這表明 CT-1的作用與 Id3 mRNA的表達有關(guān);而使用CT-1 SODN干預后,心肌成纖維細胞增殖、CT-1和 Id3 mRNA的表達均無明顯變化,由此推斷 Id3可能也在 CT-1促心肌成纖維細胞增殖或者促心肌重塑過程中發(fā)揮作用。

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11 顏素娟,李菊香,陳 靜,等 .心肌營養(yǎng)素-1在高血壓心室重塑的作〔J〕.高血壓雜志,2006;14(4):294-8.