siRNA沉默survivin基因表達對惡性膠質(zhì)瘤細胞放射敏感性的影響

張瞳光，杜利力，劉顯明，王厚中，于曉麗

（1.山東省青島市立醫(yī)院神經(jīng)外科，山東 青島 266001； 2.山東省青島市商業(yè)醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，山東 青島 266071）

惡性膠質(zhì)瘤是成人最常見的原發(fā)性惡性腦腫瘤，通常迅速導(dǎo)致患者死亡[1]，其治療方案仍局限于手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療、免疫治療及其聯(lián)合治療。放射治療是目前惡性膠質(zhì)瘤重要而有效的臨床治療手段之一，但副作用和并發(fā)癥限制了其臨床應(yīng)用。因此，增加腫瘤細胞輻射敏感性，減少放射治療的副作用和并發(fā)癥具有重要的臨床意義。目前基因治療已經(jīng)成為提高腫瘤放療敏感性的重要手段，具有廣泛的潛在臨床應(yīng)用價值[2]。Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的一個腫瘤特異性凋亡抑制因子，是凋亡抑制蛋白家族（inhibition of apoptosis proteins，IAPs）中作用最強的分子，具有抑制細胞凋亡和調(diào)節(jié)細胞周期的雙重功能，與惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[3-4]。已有文獻表明，survivin基因的高表達水平與惡性膠質(zhì)瘤的放療抗性密切相關(guān)[5]。因此，抑制survivin基因表達有可能提高惡性膠質(zhì)瘤細胞放療敏感性。筆者擬采用RNA干涉（RNAi）技術(shù)抑制survivin基因表達，觀察惡性膠質(zhì)瘤細胞放療敏感性的變化，為臨床惡性膠質(zhì)瘤的治療方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

惡性膠質(zhì)瘤細胞株（U251）購自中國科學(xué)院上海細胞研究所，在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基及37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。大腸桿菌JM109菌種為本室保存；DMEM培養(yǎng)基、TRIZOL試劑、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000和G418及T4 DNA連接酶均購自Invitrogen公司；新生小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；兔抗人survivin單抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗山羊IgG購自Santa cruz公司；RNA干涉載體pSilencer 4.0-CMV neo購自美國Ambion公司。DNA合成與測序由北京奧科生物技術(shù)有限工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 siRNA片斷的設(shè)計及合成

根據(jù)人survivin編碼區(qū)cDNA的序列（GenBank NM U75285）和載體設(shè)計的具體要求，shsurvivin 1：sense 5′-GATCCGAATTAACCCTTGGTGAATTTCAAGACGATTCACCAAGGGTTAATTCTTTTTTGAATTCA-3′；shsurvivin 2：sense 5′-GATCCGGACCACCGCATCTCTACATTCAAGACGTGTAGAGATGCGGTGGTCCTTTTTTGAATTCA-3′；片斷兩端有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點，由北京奧科生物技術(shù)有限工程公司合成。

1.2.2 干涉載體的構(gòu)建及鑒定

取 10 μL 重組質(zhì)粒，10 ×K buffer 5 μL，HindⅢ和 BamHⅠ限制性內(nèi)切核酸酶各1 μL，用無核酶三蒸水補足50 μL，37℃雙酶切6 h。酶切產(chǎn)物10 μL，2%瓊脂糖電泳。然后將細菌培養(yǎng)擴增，過夜培養(yǎng)細菌（搖至對數(shù)期），加無菌甘油，送北京奧科生物技術(shù)有限工程公司測序部，陽性克隆命名為pSil 4.1-shsurvivin 1，pSil4.1-shsurvivin 2 和 pSil 4.1-shcontrol（NC，non-specific shRNA，由美國Ambion公司提供）。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及細胞篩選

將惡性膠質(zhì)瘤細胞（U251）1.5×105/孔接種于6孔板，24 h后覆蓋率達60%～70%時進行細胞轉(zhuǎn)染。按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說明書方法進行細胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后以800 μg/mL的G418篩選14 d，再以200 μg/mL的G418維持篩選，擴增細胞。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞分別命名為U251-s1，U251-s2和U251-NC。

1.2.4 RT-PCR檢測survivin mRNA表達

收集未轉(zhuǎn)染的或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細胞系（U251，U251-NC，U251-s1，U251-s2）。采用 TRIzol法提取細胞的總 RNA，操作步驟按說明書進行，然后取總RNA 2 μg進行反轉(zhuǎn)錄。survivin引物：上游引物為 5′-CAAGGACCACCGCATCTC-3′，下游引物為 5′-TCTCCGCAGTTTCCTCAA-3′（347 bp）。β -actin（內(nèi)參）：上游引物為 5′-GGCATCGTGATGGACTCCG-3′，下游引物為 5′-GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3′（594 bp）。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測。按公式分別計算細胞中suvivin mRNA表達的抑制率：抑制率=（1-U251-s2 survivin mRNA光密度值/U251-s2 β-actin mRNA光密度值）/（U251 survivin mRNA光密度值/U251-s2 β-actin mRNA光密度值）×100%。

1.2.5 Western blot檢測survivin蛋白表達

收集未轉(zhuǎn)染的或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細胞系（U251，U251-NC，U251-s1，U251-s2）。提取細胞總蛋白，經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，10%脫脂奶粉封閉 1 h，一抗為 1∶500稀釋的 survivin和 β-actin（Santa cruz公司），二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的1∶1000稀釋的IgG。PVDF膜依次與抗體作用后與免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）反應(yīng)。X線片曝光、顯影、定影后分析表達情況。按公式分別計算細胞中suvivin蛋白表達的抑制率：抑制率=（1-U251-s2 survivin蛋白光密度值/U251-s2 β-actin蛋白光密度值）/（U251 survivin蛋白光密度值/U251-s2 β-actin蛋白光密度值）×100%。

1.2.6 體外克隆形成試驗

收集未轉(zhuǎn)染的或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細胞系（U251，U251-NC，U251-s2）。按每皿1.0×104接種于60 mm的培養(yǎng)皿中，并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。均采用西門子直線加速器MD7745（德國西門子公司生產(chǎn)）對細胞進行室溫下放射照射，劑量分別為 0，2，4，6，8 Gy。照射 24 h 后更換新的培養(yǎng)基。連續(xù)培養(yǎng)14 d后，酒精固定，再進行吉姆薩染色。細胞克隆計數(shù)并計算克隆形成率。

1.2.7 動物試驗

用100 μL的PBS稀釋1.0×107個未轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系（U251，U251-NC，U251-s2），分別注射于 8 周齡裸鼠皮下（雌雄各半，每組8只）。待皮下移植瘤直徑達7～8 mm左右時，采用西門子直線加速器MD7745分別給予放射照射治療3次，照射劑量為6.0 Gy。每隔3 d測量皮下瘤體積1次，按公式 V=0.4×長軸×短軸的平方計算體積。28 d后處死動物并測量皮下移植瘤體積。腫瘤體積抑制率=（1-U251-s2組平均皮下瘤體積/U251平均皮下瘤體積）×100%。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 13.0軟件。多組別樣本均數(shù)之間的比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定及測序

重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后電泳結(jié)果證明，pSil 4.1-shsurvivin 1和pSil 4.1-shsurvivin 2真核表達載體構(gòu)建正確，并且測序結(jié)果與所設(shè)計siRNA寡核苷酸鏈序列一致，表明重組干涉載體構(gòu)建成功。

2.2 siRNA對survivin mRNA表達水平的作用

RT-PCR檢測siRNA對survivin mRNA表達水平的作用如圖1所示：相對于未轉(zhuǎn)染的U251細胞和陰性對照組U251-NC細胞（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 pSil 4.1-NC載體），U251-s2細胞（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSil 4.1-shsurvivin 2載體）的survivin mRNA表達水平降低了約40.5%（P＜0.05），而U251-s1細胞 （穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSil4.1-shsurvivin1載體）的survivin mRNA表達水平則沒有明顯變化（P＞0.05）。

圖1 RT-PCR檢測survivin mRNA結(jié)果

2.3 siRNA對survivin蛋白表達水平的作用

Western blot檢測siRNA對survivin蛋白表達水平的作用如圖2所示：相對于未轉(zhuǎn)染的U251細胞和陰性對照組U251-NC細胞，U251-s2細胞的survivin蛋白表達水平降低了約51.8%（P＜0.05），而U251-s1細胞的survivin蛋白表達水平則沒有明顯變化（P＞0.05）。鑒于pSil 4.1-shsurvivin 2對survivin基因表達顯著的干涉作用，選擇U251-s2細胞進行后面的試驗。

圖2 Western blot檢測survivin蛋白結(jié)果

2.4 shsurvivin 2對U251細胞體外放射敏感性的影響

為了檢測survivin基因下調(diào)后對惡性膠質(zhì)瘤細胞（U251）體外放射敏感性的影響，進行了體外克隆形成試驗。結(jié)果如圖3所示：經(jīng)照射后各組細胞生存率隨著放射劑量變化逐漸降低，U251和U251-NC細胞之間的克隆形成率無明顯差別（P＞0.05），而射線照射 4，6，8，10 Gy 時，U251-s2細胞的克隆形成率較另兩組細胞明顯降低（P＜0.05）。

2.5 shsurvivin 2對U251細胞體內(nèi)放射敏感性的影響

圖3 細胞生存率變化

為了檢測survivin基因下調(diào)后對惡性膠質(zhì)瘤細胞（U251）體內(nèi)放射敏感性的影響，進行了皮下移植瘤試驗。結(jié)果如圖4所示：相對于對照組動物，U251-s2細胞皮下移植瘤動物組的瘤體積隨著時間變化抑制率逐漸增加，待28 d時抑制率達最大，為55.2%。

3 討論

Survivin是1997年Altieri等在人類基因組庫的雜交篩選中首先分離并克隆出來的凋亡蛋白抑制因子（IAP）家族中的一個重要成員，全長14.7 kb，有4個外顯子和3個內(nèi)含子[6]。Survivin基因編碼的蛋白質(zhì)含有142個氨基酸，相對分子質(zhì)量為16 200，僅含有單一的桿狀病毒IAP重復(fù)序列（baculovirus IAP repeat，BIR）功能區(qū)，通過抑制蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)過程中位于下游的caspase-3和caspase-7的活性，發(fā)揮凋亡抑制作用[7]。Survivin蛋白的生物學(xué)功能主要體現(xiàn)抑制細胞凋亡、參與細胞周期調(diào)控、促進細胞增殖、促進細胞有絲分裂、促進血管增生等方面，因此被認為是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用的一個關(guān)鍵分子[8]。Survivin基因在多種惡性腫瘤包括胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌等的腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，而在這些腫瘤組織相對應(yīng)的正常組織中并不表達survivin[9-12]。同時多篇文獻還報道，survivin基因的高表達與腫瘤細胞的化療抗性和放療抗性密切相關(guān)；而胰腺癌放療抵抗與survivin的高表達密切相關(guān)[13]。Sasaki等[14]研究表明，survivin基因的高表達水平和臨床惡性膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后不佳密切相關(guān)。但是，惡性膠質(zhì)瘤的放射敏感性與survivin表達之間的關(guān)系尚未見報道。

目前，基因功能研究的方法有多種，如基因敲除、反義寡核苷酸技術(shù)等，但費時費力，成本昂貴，且成功率不高。新近發(fā)展起來的RNA干涉技術(shù)，能快速有效地沉寂靶基因表達，進而從反向角度來闡明基因的功能，已成為當(dāng)前研究的熱點[15]。目前應(yīng)用的RNA干涉技術(shù)主要有體外合成siRNA片斷和DNA干涉載體兩類，前者的缺陷在于轉(zhuǎn)染效率低及RNA干涉作用的瞬時性，后來發(fā)展的DNA載體在細胞內(nèi)表達的siRNA技術(shù)具有穩(wěn)定、長久等優(yōu)點[16]。本研究中使用的真核表達載體pSilencer 4.1-CMVneo含有高轉(zhuǎn)錄活性的CMV啟動子，并攜帶有新霉素抗性基因，便于細胞內(nèi)高效轉(zhuǎn)錄siRNA和穩(wěn)定篩選干涉后的細胞。筆者根據(jù)siRNA序列設(shè)計原則和文獻報道合成了兩條shRNA序列，通過酶切鑒定及測序證明載體構(gòu)建成功；同時，選擇Ambion公司提供的與人類無同源性的shRNA干涉載體作為陰性對照。對于G418篩選出來的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系，分別通過RT-PCR及Western blot方法分析了survivin mRNA和蛋白水平的變化，結(jié)果表明pSil 4.1-shsurvivin 2具有抑制survivin基因表達的作用，而pSil 4.1-shsurvivin 1則沒有作用，因此選擇U251-s2作為細胞研究模型。

通過體外克隆形成試驗和皮下移植瘤試驗，發(fā)現(xiàn)survivin基因表達下調(diào)能夠顯著增強膠質(zhì)瘤細胞體內(nèi)外放療敏感性。這可能與survivin基因表達下調(diào)引起caspase-3和caspase-7活性增加有關(guān)，但具體機制還需要進一步的深入探討和分析。總之，本研究表明，聯(lián)合應(yīng)用針對survivin為靶點的基因治療和放射治療能顯著抑制惡性膠質(zhì)瘤細胞的增殖，同時又能避免放射劑量過大引起的副作用和并發(fā)癥，為惡性膠質(zhì)瘤臨床治療開辟了新的思路。

圖4 皮下移植瘤試驗

[1]Parkin DM，Bray F，F(xiàn)erlay J，et al.Global cancer statistics，2002[J].CA Cancer J Clin，2005，55（2）:74-108.

[2]Katz D，Ito E，Liu FF.On the path to seeking novel radiosensitizers[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys，2009，73（4）:988-996.

[3]Das A，Tan WL，Teo J，et al.Expression of survivin in primary glioblastomas[J].J Cancer Res Clin Oncol，2002，128（6）:302-306.

[4]Chakravarti A，Noll E，Black PM，et al.Quantitatively determined survivin expression levels are of prognostic value in human gliomas[J].J Clin Oncol，2002，20（4）:1 063-1 068.

[5]Chakravarti A，Zhai GG，Zhang M，et al.Survivin enhances radiation resistance in primary human glioblastoma cells via caspase-independent mechanisms[J].Oncogene，2004，23（45）:7 494-7 506.

[6]Ambrosini G，Adida C，Altieri DC.A novel anti-apoptosis gene，survivin，expressed in cancer and lymphoma[J].Nat Med，1997，3（8）:917-921.

[7]Li F，Ambrosini G，Chu EY，et al.Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by survivin[J].Nature，1998，396（6 711）:580-584.

[8]Mita AC，Mita MM，Nawrocki ST，et al.Survivin:key regulator of mitosis and apoptosis and novel target for cancer therapeutics[J].Clin Cancer Res，2008，14（16）:5 000-5 005.

[9]Wang TT，Qian XP，Liu BR.Survivin:potential role in diagnosis，prognosis and targeted therapy of gastric cancer[J].World J Gastroenterol，2007，13（20）:2 784-2 790.

[10]Nassar A，Sexton D，Cotsonis G，et al.Survivin expression in breast carcinoma:correlation with apoptosis and prognosis[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol，2008，16（3）:221-226.

[11]YantissRK，GoodarziM，Zhou XK，etal.Clinical，pathologic，and molecular features of early-onset colorectal carcinoma[J].Am J Surg Pathol，2009，33（4）:572-582.

[12]Montorsi M，Maggioni M，F(xiàn)alleni M，et al.Survivin gene expression in chronic liver disease and hepatocellular carcinoma[J].Hepatogastroenterology，2007，54（79）:2 040-2 044.

[13]Guan HT，Xue XH，Dai ZJ，et al.Down-regulation of survivin expression by small interfering RNA induces pancreatic cancer cell apoptosis and enhances its radiosensitivity[J].World J Gastroenterol，2006，12（18）:2 901-2 907.

[14]Sasaki T，Lopes MB，Hankins GR，et al.Expression of survivin，an inhibitor of apoptosis protein，in tumors of the nervous system[J].Acta Neuropathol，2002，104（1）:105-109.

[15]Naqvi AR，Islam MN，Choudhury NR，et al.The fascinating world of RNA interference[J].Int J Biol Sci，2009，5（2）:97-117.

[16]Tilesi F，F(xiàn)radiani P，Socci V，et al.Design and validation of siRNAs and shRNAs[J].Curr Opin Mol Ther，2009，11（2）:156-164.